PD98059联合紫杉醇对人胃印戒细胞癌细胞增殖和凋亡的影响(3)
2.4 相关凋亡蛋白表达水平采用Western blotting法检测。取对数生长期的KATO Ⅲ细胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至5×106个/mL，按100 μL/孔接种至6孔板中，培养24 h，按“2.3”项下方法分组，每组设3个复孔。对照组加入完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基2 mL，继续培养48 h。弃去培养基，用常温PBS清洗3次，每孔加入含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液100 μL，冰上裂解20 min，收集细胞裂解液，于4 ℃下以12 000 r/min离心30 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。上清液经蛋白上样缓冲液稀释后，于100 ℃下变性5 min。取变性后的蛋白适量，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，以5%脱脂奶粉于室温下封闭1 h;分别加入Cleaved-caspase-3、GAPDH一抗(稀释度均为1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜，用TBST溶液清洗5 min×3次;随后加入相应二抗(稀释度为1 ∶ 1 000) ......
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