2.10 细胞凋亡相关蛋白表达检测

    采用Western blotting法检测。按“2.4”项下方法分组、培养。培养24 h后，在冰浴条件下，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。按线粒体细胞分离试剂盒操作说明书提取线粒体蛋白和胞浆蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，于沸水中加热8 min变性。取适量变性蛋白进行SDS-PAGE，转膜0.5 h，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，在4 ℃条件下加入Bcl-2、Bax、Cyt-C、Cox Ⅳ、GAPDH一抗(稀释比例为1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜;用PBST溶液洗涤3次(每次5 min)，再加入二抗(稀释比例为1 ∶ 10 000)，室温孵育1 h，用PBST溶液洗涤3次(每次5 min)。加入特超敏ECL化学发光试剂显色，于凝胶成像系统上成像，采用J 1.52a Image软件分析，分别以Bcl-2、Bax与内参GAPDH的灰度值比值表示细胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达水平，以Cyt-C与GAPDH的灰度值比值表示胞浆内Cyt-C蛋白的表达水平，以Cyt-C与Cox Ⅳ的灰度值比值表示线粒体内Cyt-C蛋白的表达水平。试验重复3次。结果，与正常对照组比较，模型组细胞内Bcl-2和线粒体内Cyt-C蛋白的表达水平均显著降低 ......