宫颈癌患者与健康人血清蛋白质谱的差异分析
 |
| 第1页 |
参见附件。
【摘要】目的：探索宫颈癌患者与健康人群的血清蛋白质谱差异，寻找能够帮助鉴别诊断宫颈癌的候选血清蛋白标志物。方法 收集73例宫颈癌患者和56例健康人的血清标本，随机分为训练组(56例宫颈癌和36例健康人)与测试组(17例宫颈癌和2O例健康对照)。采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)技术检测所有血清标本的蛋白质谱。用Biomarker Wizard统计软件比较训练组宫颈癌与健康对照间的蛋白质谱差异，再用Biomarker Pattern软件筛选出一组差异蛋白构建决策分类树模型以鉴别宫颈癌病例和健康人群，最后用测试组对分类模型进行验证：结果 宫颈癌组和健康对照组的血清蛋白质谱存在14个差异显著的蛋白峰，以质荷比分别为3958、4288、4974、5902、8518、8930、9282和11 360的8个差异蛋白构建决策树分类模型，鉴别宫颈癌与健康对照组的敏感性为82.43 (61/4)，特异性为83.33 (30/36)，准确性为82.73 (91/110)，用测试组进行验证的敏感性为86.O5 (37/43)，特异性为65.。0 (13/20)，准确性为79.37 (50/63)。结论 宫颈癌与健康人群的血清蛋白质谱存在差异，SELDI-TOF -MS技术筛选出的血清差异蛋白有助于宫颈癌的鉴别诊断。
【关键词】宫颈肿瘤；蛋白质组学；表面增强激光解析离子化飞行时间质谱；血清；诊断
【中图分类号】R24【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2012)08-0009-01
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于宫颈癌，在发展中国家则居首位。统计数据显示，每年全世界范围内宫颈癌新增病例大约49.3万，死亡病例约27.4万，其中80%分布在发展中国家[1] 。我国每年新增宫颈癌病例约13万，占全球宫颈癌病例的1/4以上[2] 。随着宫颈癌筛查工作的开展，世界范围内宫颈癌发病率普遍下降，但是卫生条件差和经济落后地区宫颈癌发病率仍高于世界平均水平，同时宫颈癌患者年轻化的趋势不容忽视。目前仍没有理想的肿瘤标志物用于宫颈癌的早期诊断，蛋白质组学研究则使实现宫颈癌早期肿瘤标志物的筛查成为可能为了探索宫颈癌与健康人群的血清蛋白质谱差异，本研究采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)技术检测了宫颈癌与健康人群的血清蛋白质谱，比较两组的差异，并筛选差异蛋白构建分类模型，以帮助鉴别宫颈癌患者与健康人群。
1 对象与方法
1.1收集处理标本：清晨采集受试者空腹静脉血3ml，30min内放于3000r/min离心5min， 将分离的血清转入Eppendof管，再次4℃3000r/min离心5min，血清分装50μl每管，冻存于-80℃ 冰箱中备用。另取l0份正常人血清各0.5ml进行混合，制成混合对照血清，分装后-80℃保存。
1.2 制备样品混合液：取96孔细胞培养板，每孔加入10μl U9缓冲液(9M Urea，2%CHAPS，1%DTT)。将冻存血清置于冰上融解后4℃ 10000r/min离心2min，分出血清加入上述培养板中，每孔5μl， 4℃ 600r/min振荡30min。加入185μl 结合缓冲液(50mmol/L NaAC，pH4.0)，立即混匀。
1.3 上样及洗脱： 将弱阳离子交换表面芯片(CM10，美国Cipher.gen公司)装入Bioproeessor，每孔加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤3次，每次5min。甩掉缓冲液，拍于后再加入200μl HPLC水，洗涤2次，快速倾去，拍干。取出芯片，晾干后点加1μl CHCA，10min 后重复一次，晾干后即可上机测量。在不同的CM10芯片上随机选择一个点加入混合对照血清与待测样品按照上述方法进行相同处理，以评价系统误差的大小及数据的重现性。
1.4 采集数据： 利用PBSⅡ/C型蛋白质指纹图谱仪(美国Ci.phergen公司)对结合在CM10芯片表面的血清蛋白质进行检测。带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比(M/Z)与离子飞行时间的平方成正比。带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生的瞬时电流(瞬时电流I=Q/t，其中Q为t时刻检测器检测到的电荷数)转换成蛋白质的相对含量。设定优化范围为2000～20000质荷比(m/z)，最高检测分子量为100000m/z，激光强度230，检测灵敏度9。仪器采用Ciphergen公司提供的all-in-one蛋白质标准分子进行校正，设定仪器参数，系统的质量偏差≤0.1%。采用Ciphergen Proteinchip软件自动采集实验数据并进行降低基线和均一化处理，绘制出蛋白质质谱图，其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。
2 结果
2.1 试验重复性： 为保证试验重复性：① 在不同的CMIO芯片上随机选择一个点加入混合对照血清与待测样品进行相同处理，对所得蛋白质谱图进行统计分析，结果CV值为11.5%；② m/z为2045的基质峰(Matricpeak)在每个图谱中均出现，强度大致恒定，对其分析结果CV值为10.8%(<15%)；③ 将2000m/z以下的峰滤去，避免基质峰可能存在的干扰。
2.2 宫颈癌与健康对照的血清蛋白质谱差异： 经SELDI-TOF-MS系统检测得到宫颈癌和健康人血清蛋白质谱。比较训练组的宫颈癌与健康对照，两者之间共识别出33个蛋白峰，有14个蛋白峰含量的差异存在统计学意义(P<0.05。其中，相比健康对照，宫颈癌组有11个蛋白质呈高表达，3个蛋白质呈低表达。
针对验证的重要性，本组实验特别设计了独立样本来对筛选出的8个蛋白构成的分类模型进行盲法验证。经过验证，宫颈癌与健康对照组分类模型的鉴别准确度为79.37 ，虽然不是很高，但避免了数据过度拟合，具有较好的重复性。
于病例数并不大，个体差异和肿瘤异质性的影响可能较大，下一步笔者将在此基础上扩大样本，筛选更具代表性的差异蛋白构建分类模型，有望提高诊断的准确度。同时，还需后续的验证性研究，以确定结果在时间和批次上的稳定性；对于筛选出的差异蛋白，将对其开展鉴定研究，以期为寻找宫颈癌的血清标志物提供进一步帮助。参考文献
[1]Parkin DM.The global health burden of infection.assisted cancers in the year 2002[J].Int J Cancer，2006，118(12)：3030-3044.
[2]Shi JF，Qiao YL，Smith JS，et a1.Epidemiology and prevention of human papillomavirus and cervical cancer in China and Mongolia [J].Vaccine，2008，26(Suppl 12)：M53-M59.
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(1463kb)。