CD4+CD25+调节性T细胞与子宫内膜癌的相关性及其在免疫逃逸中的作用机制研究
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【摘要】肿瘤作为机体的非我成分，免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤细胞增生和转移。大量研究提示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态，肿瘤在逃逸机体的免疫机制之后才得以进展。随着免疫学、分子生物学及基因生物工程技术的发展，以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为继手术、化疗、放疗治疗肿瘤的新模式。CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)，参与了肿瘤免疫耐受机制，这类细胞具有免疫抑制及免疫无能等特性。随着肿瘤的免疫治疗成为肿瘤治疗的重要手段之一，Treg细胞在肿瘤治疗方面的应用也成为研究的热点。基于上述理论基础，本实验将探讨CD4+CD25+ Treg 细胞在子宫内膜癌局部和全身免疫中的作用机制，旨在为子宫内膜癌的预防及生物治疗方面提供新的切入点。目的 应用流式细胞仪技术检测子宫内膜癌患者外周血及癌组织局部的CD4+CD25+Treg细胞水平探讨其与子宫内膜癌发生发展的关系、在肿瘤免疫逃逸中的作用及机制，以期为有效地对子宫内膜癌进行免疫治疗提供理论依据。方法：26例子宫内膜癌患者外周血经Ficoll梯度离心分离单个核细胞，取手术切除的新鲜肿瘤组织进行肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)和非肿瘤浸润性淋巴细胞(NILs)制备。应用流式细胞仪分析CD4+CD25+Treg细胞的分布比例，并与25例年龄相匹配的健康对照者外周血CD4+CD25+Treg细胞比例为对照。比较26例不同病理类型、不同分期的子宫内膜癌外周血CD4+CD25+Treg细胞比例，并用ELISA方法检测同标本血中Treg细胞分泌的抑制性细胞因子IL-10和转化生长因子(TGF-β)水平及趋化因子受体CCR4水平。结果 子宫内膜癌患者体内IL-10、TGF-β水平明显高于对照组，提示Treg通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子及细胞接触依赖的抑制途径，抑制免疫效应细胞，进一步促进肿瘤细胞的免疫逃逸。 结论 子宫内膜癌患者体内CD4+CD25+Treg细胞明显上调，且在肿瘤组织局部表现更为明显，这可能参与了肿瘤的免疫逃逸，促进肿瘤生长和演进，机制可能与IL-10、TGF-β及CCR4表达上调有关。
【关键词】子宫内膜癌；CD4+CD25+ Treg细胞；免疫逃逸； 流式细胞仪； ELISA；IL-10；TGF-β
【中图分类号】Q939.91【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2012)09-0179-03
1研究对象
选择2009年01月-2012年01月就诊于我科的子宫内膜癌患者26例，年龄28-75岁，平均(51.09±6.88)岁，所有病例均经病理学检查确诊，未做过抗肿瘤治疗，且3个月内未使用过免疫增强或抑制剂，手术病理分期、组织分类均参照国际妇产科联盟2000年标准进行。子宫内膜样腺癌10例，腺鳞癌8例，透明细胞癌3例，鳞癌5例，FIGO分期：Ⅰ期+Ⅱ期10例，Ⅲ期+IV期16例。另选择经年龄相匹配的25位健康志愿者作为正常对照组，年龄30-81岁，平均(54.25±9.20)岁。
2研究方法
2.1 标本处理：
2.1.1 外周血单个核细胞(PBMCs)制备： 采集研究对象术前、健康志愿者同一时间外周静脉血2ml，EDTA抗凝；15ml离心管内加入适量淋巴细胞分离液，将EDTA抗凝血用PBS等倍稀释后，轻缓铺在分离液面上；离心1200rpm×10min；吸取界面细胞，冰PBS洗涤2次后重悬细胞备用。
2.1.2肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)和非肿瘤浸润性淋巴细胞(NILs)制备：取手术切除的新鲜肿瘤组织、洗净，在无菌条件下去除坏死组织及结缔组织，剔除脂肪组织，剪成1mm3大小的组织块；在碎组织块中加入终浓度0.1%的胶原酶，置4℃条件下消化24小时，细胞悬液经100目钢丝或尼龙网过滤，过滤后的细胞悬液以50rpm离心10min，弃上清，加适量Hanks液稀释，在试管中依次加入100% Ficoll-Hypaque分离液、75% Ficoll-Hypaque分离液及细胞悬液，进行不连续密度梯度离心，2000rpmx10min，收集75%与100%之间界面上的细胞悬液备用。取距离肿瘤5cm的组织作为对照，制备非肿瘤浸润性淋巴细胞，方法同上。
2.2流式细胞仪检测：将PBMCs/TILs/NILs加样至流式检测管内，每管至少2×105个细胞，加入CD4-PE、CD25-FITC单抗和CCR4-PE，4℃孵育20分钟，加入PBS 2ml洗涤，并以200g离心沉淀5分钟，吸去上清，混匀细胞后加入0.5ml l%多聚甲醛，上流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司产品)检测或置2-8℃冰箱中备用。
2.3 ELISA法测定IL-10和TGF-β水平：取100μL标准品，各组血清加入相应试剂板的微孔中，再加入生物素化抗体工作液 100μL/孔，用封板胶纸封住反应孔 ......
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