血管内皮生长因子在促进颅骨缺损修复中的实验研究(1)
【摘要】目的：探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor ， VEGF)促进成骨缺损修复的机制。方法：雄性新西兰大白兔 24只，体重1.5～2.0 kg。在兔颅骨两侧分别建立一个1cm×0.5cm全层骨缺损区，同时去除该区骨膜、保护硬脑膜。随机选择一侧骨缺损作实验侧，植入复合PRP 的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。术后第2、4、8、12 周末分别处死兔6只取材。免疫组织化学法测定骨缺损修复区域血管内皮生长因子的表达； Image-proplus 5.0图像分析软件做VEGF表达强度的灰度测量。采用SSPS 16.0进行t检验统计学分析。结果：两组相比，在第2、4周时差异均有显著性(P <0.05)，有统计学意义。结论：血管内皮生长因子在实验组早期阶段的强阳性表达，说明血管形成活跃。PRP促进骨修复的作用发生在植入后早期，启动了早期活跃的成骨。
【关键词】脱细胞骨基质；骨缺损修复；血管内皮生长因子；兔
【中图分类号】R651.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)03-0010-01
骨缺损的修复是骨组织再生的过程，其基础则是伤口血管的形成和生长，血管的长入在组织修复中起着不可或缺的作用[1] 。修复过程中，在复杂的生物学调节机制作用下，各种各样的细胞因子在不同的骨缺损愈合阶段发挥各自不同的功能。其中，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor ， VEGF) 是最重要的促血管生成因子[2] ，在骨缺损愈合过程中发挥重要的作用。本文以兔为实验对象，观察VEGF在骨缺损修复过程中的表达、分布及其促进成骨的作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂
雄性新西兰大白兔 24只(山东大学医学院提供)，质量1.5～2.0 kg。牛凝血酶(上海第一生化药业有限公司)；10%枸椽酸钠(济南天和化工有限公司)；10%氯化钙(济南天和化工有限公司)；ABM(上海市组织工程重点实验室)
1.2 兔颅骨缺损区制备
3%的戊巴比妥钠按1mL/kg兔耳缘静脉注射麻醉成功后，颅顶部备皮，手术区常规消毒铺无菌巾单。耳前眶后正中部位切开皮肤及皮下组织，于骨膜上向两侧分离皮肤及皮下组织，中线处切开骨膜，向两侧游离至拟制备骨缺损范围稍外处切除之。用牙科微动力牙钻分别于颅正中缝左右两侧约0.5cm处各制备1.0cm×0.5cm的颅骨全层缺损，制备过程中以无菌生理盐水降温，并注意勿损伤硬脑膜，冲冼术区碎骨屑，无菌盐水纱布覆盖。
1.3 PRP制备、活化及与ABM复合
0.15g无菌ABM颗粒置于无菌托盘待用。按Marx等[3]所介绍的两次离心方法制备PRP。耳中央动脉抽取全血5mL，注入预先放入0.3 mL枸椽酸钠的无菌试管，2500r/min离心10min，取上清液至中间层以下1mm处移至另一无菌试管，再次以3000r/min离心10min，弃去上2/3，余下的1/3为约0.5mL PRP。10%无菌CaCl2溶液0.5mL溶解牛凝血酶50IU制备成PRP活化剂溶液，2mL注射器吸取该溶液0.3mL，PRP 0.5ml和1ml空气，混匀后转移至ABM颗粒处并与之充分混合。静置1-2 min，混合物即成胶冻状。可见ABM颗粒均匀分布于胶冻状物质中，表示PRP活化并与ABM复合成功。
1.4 颅骨缺损修复及分组
随机选择一侧骨缺损作实验侧，植入复合PRP 的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。逐层缝合切口。常规饮食， 术后3 d 每天40 万U 青霉素肌注。分别于术后2，4，8，12周取材，暴露颅骨，去除骨缺损处粘连的软组织，在骨缺损周围0.5cm正常骨质处全层整块取下颅顶骨，冲冼标本，去除表面血污，放入4%多聚甲醛固定液中，4℃条件下固定24h。然后常规免疫组织化学染色，阴性对照：用PBS代替一抗工作液，重复以上操作。
1.6 VEGF表达强度结果观察
VEGF的阳性表达定位于胞质，呈浅黄色至棕黄色不等，随着表达强度的增高颜色加深。阴性：细胞无着色，阳性：细胞染成淡黄色，强阳性：细胞染成棕黄色。表达细胞包括成骨细胞、成纤维细胞、破骨细胞，新生血管内皮细胞等。实验组和对照组每侧标本随机选取6张VEGF免疫组织化学切片，在显微镜下取40倍视野，将图像采集入Image-proplus 5.0病理图像分析系统，每张切片观察5个视野，观察不同时间点两组骨缺损区域VEGF的表达强度情况。随机测10个阳性染色点灰度值，最后取平均灰度值，染色越深，灰度值越低。
1.7 实验数据的统计学处理
各组VEGF表达强度平均灰度值结果的对比采用SPSS 16.0统计学软件进行配对资料的t检验，结果用均数士标准差表示，以p <0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 VEGF在骨缺损修复中的表达强度灰度值
Image-proplus 5.0病理图像分析系统测量两组VEGF表达强度。结果显示，随着时间的延长，两组的VEGF表达均呈逐渐降低的趋势。但实验组在2周至4周的时间区间内VEGF表达呈急剧下降，4周至8周至12周，下降趋于平缓。对照组在2周和4周时均呈强阳性表达。两组VEGF表达强度在2周和4周的差异有显著性(P <0.01) ，有统计学意义，而在8周和12周差异无显著性(P >0.05)。
3讨论
3.1兔颅骨骨缺损模型的建立
兔的头皮层较薄，颅骨易于显露，制备骨缺损手术操作相对简单易行，术区结构简单，相对安全。本实验参照多位学者成功的研究结果建立了兔颅骨骨缺损的模型，此种类型兔颅骨骨缺损，如果不加入干预因素，如植入移植材料等，不能达到自然愈合，最后只能以软组织瘢痕充填缺损区域[4，5] 。有了以上研究基础，本实验无需设计空白对照组。且本实验采用动物自身对照的设计方案，避免了由于动物个体差异造成的偏倚，提高了不同干预方法之间进行结果比较的可靠性。, http://www.100md.com(韩金友 袁道英)
【关键词】脱细胞骨基质；骨缺损修复；血管内皮生长因子；兔
【中图分类号】R651.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)03-0010-01
骨缺损的修复是骨组织再生的过程，其基础则是伤口血管的形成和生长，血管的长入在组织修复中起着不可或缺的作用[1] 。修复过程中，在复杂的生物学调节机制作用下，各种各样的细胞因子在不同的骨缺损愈合阶段发挥各自不同的功能。其中，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor ， VEGF) 是最重要的促血管生成因子[2] ，在骨缺损愈合过程中发挥重要的作用。本文以兔为实验对象，观察VEGF在骨缺损修复过程中的表达、分布及其促进成骨的作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂
雄性新西兰大白兔 24只(山东大学医学院提供)，质量1.5～2.0 kg。牛凝血酶(上海第一生化药业有限公司)；10%枸椽酸钠(济南天和化工有限公司)；10%氯化钙(济南天和化工有限公司)；ABM(上海市组织工程重点实验室)
1.2 兔颅骨缺损区制备
3%的戊巴比妥钠按1mL/kg兔耳缘静脉注射麻醉成功后，颅顶部备皮，手术区常规消毒铺无菌巾单。耳前眶后正中部位切开皮肤及皮下组织，于骨膜上向两侧分离皮肤及皮下组织，中线处切开骨膜，向两侧游离至拟制备骨缺损范围稍外处切除之。用牙科微动力牙钻分别于颅正中缝左右两侧约0.5cm处各制备1.0cm×0.5cm的颅骨全层缺损，制备过程中以无菌生理盐水降温，并注意勿损伤硬脑膜，冲冼术区碎骨屑，无菌盐水纱布覆盖。
1.3 PRP制备、活化及与ABM复合
0.15g无菌ABM颗粒置于无菌托盘待用。按Marx等[3]所介绍的两次离心方法制备PRP。耳中央动脉抽取全血5mL，注入预先放入0.3 mL枸椽酸钠的无菌试管，2500r/min离心10min，取上清液至中间层以下1mm处移至另一无菌试管，再次以3000r/min离心10min，弃去上2/3，余下的1/3为约0.5mL PRP。10%无菌CaCl2溶液0.5mL溶解牛凝血酶50IU制备成PRP活化剂溶液，2mL注射器吸取该溶液0.3mL，PRP 0.5ml和1ml空气，混匀后转移至ABM颗粒处并与之充分混合。静置1-2 min，混合物即成胶冻状。可见ABM颗粒均匀分布于胶冻状物质中，表示PRP活化并与ABM复合成功。
1.4 颅骨缺损修复及分组
随机选择一侧骨缺损作实验侧，植入复合PRP 的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。逐层缝合切口。常规饮食， 术后3 d 每天40 万U 青霉素肌注。分别于术后2，4，8，12周取材，暴露颅骨，去除骨缺损处粘连的软组织，在骨缺损周围0.5cm正常骨质处全层整块取下颅顶骨，冲冼标本，去除表面血污，放入4%多聚甲醛固定液中，4℃条件下固定24h。然后常规免疫组织化学染色，阴性对照：用PBS代替一抗工作液，重复以上操作。
1.6 VEGF表达强度结果观察
VEGF的阳性表达定位于胞质，呈浅黄色至棕黄色不等，随着表达强度的增高颜色加深。阴性：细胞无着色，阳性：细胞染成淡黄色，强阳性：细胞染成棕黄色。表达细胞包括成骨细胞、成纤维细胞、破骨细胞，新生血管内皮细胞等。实验组和对照组每侧标本随机选取6张VEGF免疫组织化学切片，在显微镜下取40倍视野，将图像采集入Image-proplus 5.0病理图像分析系统，每张切片观察5个视野，观察不同时间点两组骨缺损区域VEGF的表达强度情况。随机测10个阳性染色点灰度值，最后取平均灰度值，染色越深，灰度值越低。
1.7 实验数据的统计学处理
各组VEGF表达强度平均灰度值结果的对比采用SPSS 16.0统计学软件进行配对资料的t检验，结果用均数士标准差表示，以p <0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 VEGF在骨缺损修复中的表达强度灰度值
Image-proplus 5.0病理图像分析系统测量两组VEGF表达强度。结果显示，随着时间的延长，两组的VEGF表达均呈逐渐降低的趋势。但实验组在2周至4周的时间区间内VEGF表达呈急剧下降，4周至8周至12周，下降趋于平缓。对照组在2周和4周时均呈强阳性表达。两组VEGF表达强度在2周和4周的差异有显著性(P <0.01) ，有统计学意义，而在8周和12周差异无显著性(P >0.05)。
3讨论
3.1兔颅骨骨缺损模型的建立
兔的头皮层较薄，颅骨易于显露，制备骨缺损手术操作相对简单易行，术区结构简单，相对安全。本实验参照多位学者成功的研究结果建立了兔颅骨骨缺损的模型，此种类型兔颅骨骨缺损，如果不加入干预因素，如植入移植材料等，不能达到自然愈合，最后只能以软组织瘢痕充填缺损区域[4，5] 。有了以上研究基础，本实验无需设计空白对照组。且本实验采用动物自身对照的设计方案，避免了由于动物个体差异造成的偏倚，提高了不同干预方法之间进行结果比较的可靠性。, http://www.100md.com(韩金友 袁道英)