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编号:12717740
血管内皮生长因子在促进颅骨缺损修复中的实验研究(1)
http://www.100md.com 2014年3月1日 《医学美学美容·中旬刊》 2014年第3期
     【摘要】目的:探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)促进成骨缺损修复的机制。方法:雄性新西兰大白兔 24只,体重1.5~2.0 kg。在兔颅骨两侧分别建立一个1cm×0.5cm全层骨缺损区,同时去除该区骨膜、保护硬脑膜。随机选择一侧骨缺损作实验侧,植入复合PRP 的ABM;另一侧为对照侧,仅植入ABM。术后第2、4、8、12 周末分别处死兔6只取材。免疫组织化学法测定骨缺损修复区域血管内皮生长因子的表达; Image-proplus 5.0图像分析软件做VEGF表达强度的灰度测量。采用SSPS 16.0进行t检验统计学分析。结果:两组相比,在第2、4周时差异均有显著性(P <0.05),有统计学意义。结论:血管内皮生长因子在实验组早期阶段的强阳性表达,说明血管形成活跃。PRP促进骨修复的作用发生在植入后早期,启动了早期活跃的成骨。

    【关键词】脱细胞骨基质;骨缺损修复;血管内皮生长因子;兔

    【中图分类号】R651.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)03-0010-01

    骨缺损的修复是骨组织再生的过程,其基础则是伤口血管的形成和生长,血管的长入在组织修复中起着不可或缺的作用[1] 。修复过程中,在复杂的生物学调节机制作用下,各种各样的细胞因子在不同的骨缺损愈合阶段发挥各自不同的功能。其中,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF) 是最重要的促血管生成因子[2] ,在骨缺损愈合过程中发挥重要的作用。本文以兔为实验对象,观察VEGF在骨缺损修复过程中的表达、分布及其促进成骨的作用机制。

    1材料与方法

    1.1实验动物及试剂

    雄性新西兰大白兔 24只(山东大学医学院提供),质量1.5~2.0 kg。牛凝血酶(上海第一生化药业有限公司);10%枸椽酸钠(济南天和化工有限公司);10%氯化钙(济南天和化工有限公司);ABM(上海市组织工程重点实验室)

    1.2 兔颅骨缺损区制备

    3%的戊巴比妥钠按1mL/kg兔耳缘静脉注射麻醉成功后,颅顶部备皮,手术区常规消毒铺无菌巾单。耳前眶后正中部位切开皮肤及皮下组织,于骨膜上向两侧分离皮肤及皮下组织,中线处切开骨膜,向两侧游离至拟制备骨缺损范围稍外处切除之。用牙科微动力牙钻分别于颅正中缝左右两侧约0.5cm处各制备1.0cm×0.5cm的颅骨全层缺损,制备过程中以无菌生理盐水降温,并注意勿损伤硬脑膜,冲冼术区碎骨屑,无菌盐水纱布覆盖。

    1.3 PRP制备、活化及与ABM复合

    0.15g无菌ABM颗粒置于无菌托盘待用。按Marx等[3]所介绍的两次离心方法制备PRP。耳中央动脉抽取全血5mL,注入预先放入0.3 mL枸椽酸钠的无菌试管,2500r/min离心10min,取上清液至中间层以下1mm处移至另一无菌试管,再次以3000r/min离心10min,弃去上2/3,余下的1/3为约0.5mL PRP。10%无菌CaCl2溶液0.5mL溶解牛凝血酶50IU制备成PRP活化剂溶液,2mL注射器吸取该溶液0.3mL,PRP 0.5ml和1ml空气,混匀后转移至ABM颗粒处并与之充分混合。静置1-2 min,混合物即成胶冻状。可见ABM颗粒均匀分布于胶冻状物质中,表示PRP活化并与ABM复合成功。

    1.4 颅骨缺损修复及分组

    随机选择一侧骨缺损作实验侧,植入复合PRP 的ABM;另一侧为对照侧,仅植入ABM。逐层缝合切口。常规饮食, 术后3 d 每天40 万U 青霉素肌注。分别于术后2,4,8,12周取材,暴露颅骨,去除骨缺损处粘连的软组织,在骨缺损周围0.5cm正常骨质处全层整块取下颅顶骨,冲冼标本,去除表面血污,放入4%多聚甲醛固定液中,4℃条件下固定24h。然后常规免疫组织化学染色,阴性对照:用PBS代替一抗工作液,重复以上操作。

    1.6 VEGF表达强度结果观察

    VEGF的阳性表达定位于胞质,呈浅黄色至棕黄色不等,随着表达强度的增高颜色加深。阴性:细胞无着色,阳性:细胞染成淡黄色,强阳性:细胞染成棕黄色。表达细胞包括成骨细胞、成纤维细胞、破骨细胞,新生血管内皮细胞等。实验组和对照组每侧标本随机选取6张VEGF免疫组织化学切片,在显微镜下取40倍视野,将图像采集入Image-proplus 5.0病理图像分析系统,每张切片观察5个视野,观察不同时间点两组骨缺损区域VEGF的表达强度情况。随机测10个阳性染色点灰度值,最后取平均灰度值,染色越深,灰度值越低。

    1.7 实验数据的统计学处理

    各组VEGF表达强度平均灰度值结果的对比采用SPSS 16.0统计学软件进行配对资料的t检验,结果用均数士标准差表示,以p <0.05为差异有显著性。

    2 结果

    2.1 VEGF在骨缺损修复中的表达强度灰度值

    Image-proplus 5.0病理图像分析系统测量两组VEGF表达强度。结果显示,随着时间的延长,两组的VEGF表达均呈逐渐降低的趋势。但实验组在2周至4周的时间区间内VEGF表达呈急剧下降,4周至8周至12周,下降趋于平缓。对照组在2周和4周时均呈强阳性表达。两组VEGF表达强度在2周和4周的差异有显著性(P <0.01) ,有统计学意义,而在8周和12周差异无显著性(P >0.05)。

    3讨论

    3.1兔颅骨骨缺损模型的建立

    兔的头皮层较薄,颅骨易于显露,制备骨缺损手术操作相对简单易行,术区结构简单,相对安全。本实验参照多位学者成功的研究结果建立了兔颅骨骨缺损的模型,此种类型兔颅骨骨缺损,如果不加入干预因素,如植入移植材料等,不能达到自然愈合,最后只能以软组织瘢痕充填缺损区域[4,5] 。有了以上研究基础,本实验无需设计空白对照组。且本实验采用动物自身对照的设计方案,避免了由于动物个体差异造成的偏倚,提高了不同干预方法之间进行结果比较的可靠性。, http://www.100md.com(韩金友 袁道英)
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