刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、生物信息学及表达分析(2)
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1.45′RACE技术获取刺五加FPS基因cDNA 5′末端序列参照罗聪[9]等的方法进行5′RACE扩增。根据1.3中所获得的刺五加FPS基因保守片段的cDNA序列，应用Primer premier 5.0 设计5′RACE特异性引物FPS52：5′CACTGCTTGTACCGCTTGGCTC3′和FPS51：5′CAGGGTTGACCTCTGCGTGTAT3′。锚定引物AP长：5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG3′，通用上游接头引物AP短：5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′。取总RNA 3 μL，采用PrimeScript逆转录酶，以AUP1：5′GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′为引物，根据PrimeScript逆转录酶的说明进行逆转录反应，合成cDNA第1链。逆转录反应体系25 μL。逆转录完成后，按照说明书要求用RNase H处理1 h。然后用PCR产物纯化试剂盒将RNase H产物纯化。纯化后的产物根据TdT说明书的要求，以50 μL体系进行TdT末端加尾，加尾2 h。加尾完成后用PCR纯化试剂盒纯化加尾产物，获得加尾的cDNA。应用巢式PCR和降落PCR技术进行RACE扩增。第1轮PCR的引物为AP长和FPS52。反应体系为：加尾产物1 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Dream Taq酶0.62 μL，Buffer 2.5 μL，补ddH2O至25 μL。反应条件为：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，30 s；退火62 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s，共2个循环；变性95 ℃，30 s；退火60 ℃ ......
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