内生真菌对刺五加皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响(2)
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参见附件。
1.5Real time PCR检测刺五加关键酶基因的表达
1.5.1总RNA的提取与逆转录按照植物RNA提取试剂盒说明书的要求，回接内生真菌后，每隔30 d，称取0.1 g各样本刺五加叶片提取总RNA，共4次，分别为5月26日、6月26日、7月26日，8月26日。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计测定纯度和浓度。参考RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit逆转录试剂的说明，取总RNA 3 μL，以Oligo(dT)18为引物，合成cDNA第1链，反应总体系20 μL。
1.5.2引物的合成根据已克隆的刺五加GAPDH(HQ184063)，SS(HQ456919)，SE(JF818129)，bAS(JF818130)基因序列，利用Primer premier 5.0设计Real time PCR特异性引物。GAPDH的上游引物为5′GATTTGGCATTGTTGAGGG3′，下游引物为5′TGCTATCGCCTATGAAGTCC3′；SS的上游引物为5′GACACTGTTGAGGATGACACA3′，下游引物为5′GCCAAATCTTCTAACCCAGA3′；SE的上游引物为5′CGAGATTCGGTGTTTGGT3′，下游引物为5′ GGTTGATGAGTCACGGAGA3′；bAS的上游引物为5′TGGTCCAATCAATCCTCTCA3′，下游引物为5′CCCAACAAGCAAGCATACAG3′ ......
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