刺五加钙调蛋白基因的克隆及内生真菌对其表达的影响(2)
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参见附件。
1.3 RACE技术获取刺五加CaM基因cDNA 5′末端和3′末端序列 根据1.2中所获得的刺五加CaM cDNA序列，设计5′RACE特异性引物CaM52：5′AGCCTCCCGTATCATCTCGTCA3′和CaM51：5′CGACCTCATCACAGTCCCAAGC3′，参照罗聪等[11]的方法，进行逆转录、加尾和5′RACE扩增。同时设计3′RACE特异性外侧引物CaM32：5′TTGGGACTGTGATGAGGTCG3′和内侧引物CaM31：5′GGAAGATGAAGGATACCGACTC3′。按照3′Full RACE core set Ver20说明书的要求逆转录和3′RACE扩增，反应体系中模板量为3 μL，2轮PCR的退火温度均为54 ℃，延伸均为1 min，其他按照说明书进行。按照1.2中的方法对RACE产物进行回收、克隆和测序。
1.4 刺五加CaM基因全长的拼接与PCR验证 利用DNAMAN 6.0软件将1.2中获得的保守序列和1.3中获得的5′末端、3′末端序列进行拼接，获得刺五加CaM基因的全长cDNA序列。根据拼接的序列，设计扩增刺五加CaM基因全长cDNA的上游引物ECaMAS：5′CCCGCTTACCTCTTTGTCT3′和下游引物ECaMAX：5′TTCCATCACCACCACCATA3′。以1.2中逆转录的cDNA为模板，利用ECaMASECaMAX引物对PCR扩增CaM cDNA的全长序列 ......
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