基于木通皂苷探讨中药质量评价用对照提取物研究(1)
[摘要] 在分析总结中药对照提取物应用现状的基础上，提出中药质量评价用对照提取物根据用途不同，分为3类：①药材或挥发油对照提取物，用于原药材提取物或含原药材的中成药薄层鉴别；②组分对照提取物，用于某类组分鉴别或色谱峰定位；③标示了待测成分含量的对照提取物，可用于样品的定量分析。针对第3类对照提取物，以木通皂苷为例，从制备工艺、成分鉴定和含量分析等方面探讨了其研制思路和方法。
[关键词] 木通皂苷； 质量评价； 对照提取物
中药对照提取物是一类多成分的对照物质，用作薄层定性鉴别、特殊样品分析时色谱峰定位或者定量用混合对照品使用。根据用途不同，对照提取物的物质内涵和研制思路亦不相同。鉴于目前对照提取物的品种、数量较少，国家标准体系中尚未制定具体的技术细则。本文在简要概述对照提取物应用现状的基础上，以木通皂苷对照提取物为例，从制备工艺、成分鉴定和含量分析等方面阐明作者关于定量用对照提取物的研究思路，供同行参考指正。
, http://www.100md.com
1 中药对照提取物分类和内涵
受到中药化学对照品分离难度大、天然含量低或化学性质不稳定或供应价格高等诸多因素的制约，采用对照提取物进行中药质量评价被认为是实现多指标质量控制模式值得推荐并深入研究的对策之一。2010年版《中国药典》收载了16种药材、挥发油或组分对照提取物，分别为银杏叶提取物、云南白药提取物、乌灵菌粉、发酵虫草菌粉、八角茴香油、广藿香油、木香挥发油、牡荆油、松节油、温莪术油、薄荷素油、檀香油、三七总皂苷、穿龙薯蓣皂苷提取物、总银杏酸、黄山药皂苷提取物[2]。根据它们的实际应用情况，分为3类：①药材或挥发油对照提取物，主要用于原药材提取物或含原药材中成药的薄层鉴别，与待分析样品共薄层展开，相当于同时采用多个对照品进行鉴别，与单一对照品相比，提高了鉴别的专属性，与对照药材相比，简略了制备过程；②组分对照提取物，用于待测样品中某类组分鉴别或色谱峰定位，比如银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊质量标准中总银杏酸检查项下各色谱峰的定位；③标示了多个待测成分含量的对照提取物用于定量分析，比如标示槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的银杏叶对照提取物用于银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊总黄酮苷的含量测定或者标示白果内酯，银杏内酯A，银杏内酯B和银杏内酯C含量的银杏叶对照提取物用于银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊萜类内酯的含量测定。
, 百拇医药
第1类对照提取物，研究时可选取1批或多批原药材混合，按照稳定、统一的工艺条件，制成具有代表性的、相同检测条件下色谱行为稳定，可重复的对照提取物；对于多基原的药材固定品种，必要时明确并固定产地；应用时可以避免采用对照药材的繁琐提取过程，溶解后直接使用；按照用途可分为用于配方颗粒用的对照提取物，即以水提取制备的对照物质，和用于代替对照药材的一般对照提取物，即全成分的对照物质。第2类对照提取物，根据原药材所含有效成分或活性成分的性质，研究具有选择性提取、纯化、重复性好的制备工艺，获得某类总成分的对照提取物。第3类对照提取物，制备工艺稳定，化学组成清晰，所含成分个数相对较少，主要用作多指标同步测定时混合对照品使用。第1， 2类对照提取物研制相对简单；第3类对照提取物不仅要求制备工艺稳定、具备可重复性，尚需对物质组成进行定性定量分析，对其定值进行准确标化。因此，本文以木通皂苷对照提取物为例，探讨中药质量评价定量用对照提取物的研究方法。
2 基于木通皂苷探讨对照提取物研究
, http://www.100md.com
木通为木通科植物木通Akebia quinata (Thunb.) Decne，三叶木通A. trifoliata (Thunb.) Koidz或白木通A. trifoliata(Thunb.)Koidz. var. australis (Diels) Rehd.的干燥藤茎，化学研究表明其化学成分主要为苯乙醇苷类和三萜皂苷类。2010年版《中国药典》收载了以木通苯乙醇B为对照品的定性定量分析[2]，尚缺乏皂苷类评价指标用于药材及中成药的质量控制。本研究针对含3个化学结构相似、性质相近、极难纯化的木通皂苷对照提取物进行探索研究，为木通药材及其中成药多指标质量控制提供新形式的对照物质，或可为其他定量用对照提取物的研制提供可借鉴的思路和方法。
2.1 仪器与试药
岛津LC20A高效液相系统(日本岛津公司)，配备四元泵、自动进样器、在线脱气机和二极管阵列检测器；安捷伦6320高效液相质谱联用仪(安捷伦公司)，配备电喷雾离子源和离子阱质谱检测器；HPD100大孔吸附树脂(河北沧州)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂分厂)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)；反相色谱硅胶(Fuji Silysia Chemical， Japan)；白木通皂苷B，木通皂苷PJ1和白木通皂苷C对照品由本实验室分离纯化并鉴定结构，纯度>98%(HPLC面积归一化法)；甲醇、乙腈(色谱级，德国fisher公司)，娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
分离用白木通药材采于四川，为木通科木通属植物白木通A. trifoliate var. australis的干燥藤茎。
2.2 方法与结果
2.2.1 木通皂苷对照提取物的制备 白木通药材1 kg，分别用10，10，8倍量沸水煎煮3次，每次1 h，滤过，合并煎煮液，静置过夜，离心(3 500 r·min-1，20 min)，上清液过HPD100大孔吸附树脂柱，依次用10倍柱体积的水，30%，50%，70% ，95%乙醇洗脱，收集含目标成分的50%乙醇洗脱液，减压干燥，计算得率(半制备组分Ⅰ)。50%乙醇洗脱部位甲醇溶解，滤除不溶性杂质，滤液硅胶拌样，进行硅胶减压柱色谱(200～300目)，氯仿甲醇水(15∶6∶1)等度洗脱，合并第3～5 倍柱体积的洗脱液，干燥，称重，计算粗品得率(半制备组分Ⅱ)。粗品经ODSC18柱色谱纯化，得木通皂苷对照提取物，计算得率(半制备组分Ⅲ)。重复上述工艺制备3批样品，各批次样品得率见表1。, 百拇医药(袁贤达 高慧敏 王智民 张启伟)
[关键词] 木通皂苷； 质量评价； 对照提取物
中药对照提取物是一类多成分的对照物质，用作薄层定性鉴别、特殊样品分析时色谱峰定位或者定量用混合对照品使用。根据用途不同，对照提取物的物质内涵和研制思路亦不相同。鉴于目前对照提取物的品种、数量较少，国家标准体系中尚未制定具体的技术细则。本文在简要概述对照提取物应用现状的基础上，以木通皂苷对照提取物为例，从制备工艺、成分鉴定和含量分析等方面阐明作者关于定量用对照提取物的研究思路，供同行参考指正。
, http://www.100md.com
1 中药对照提取物分类和内涵
受到中药化学对照品分离难度大、天然含量低或化学性质不稳定或供应价格高等诸多因素的制约，采用对照提取物进行中药质量评价被认为是实现多指标质量控制模式值得推荐并深入研究的对策之一。2010年版《中国药典》收载了16种药材、挥发油或组分对照提取物，分别为银杏叶提取物、云南白药提取物、乌灵菌粉、发酵虫草菌粉、八角茴香油、广藿香油、木香挥发油、牡荆油、松节油、温莪术油、薄荷素油、檀香油、三七总皂苷、穿龙薯蓣皂苷提取物、总银杏酸、黄山药皂苷提取物[2]。根据它们的实际应用情况，分为3类：①药材或挥发油对照提取物，主要用于原药材提取物或含原药材中成药的薄层鉴别，与待分析样品共薄层展开，相当于同时采用多个对照品进行鉴别，与单一对照品相比，提高了鉴别的专属性，与对照药材相比，简略了制备过程；②组分对照提取物，用于待测样品中某类组分鉴别或色谱峰定位，比如银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊质量标准中总银杏酸检查项下各色谱峰的定位；③标示了多个待测成分含量的对照提取物用于定量分析，比如标示槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的银杏叶对照提取物用于银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊总黄酮苷的含量测定或者标示白果内酯，银杏内酯A，银杏内酯B和银杏内酯C含量的银杏叶对照提取物用于银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊萜类内酯的含量测定。
, 百拇医药
第1类对照提取物，研究时可选取1批或多批原药材混合，按照稳定、统一的工艺条件，制成具有代表性的、相同检测条件下色谱行为稳定，可重复的对照提取物；对于多基原的药材固定品种，必要时明确并固定产地；应用时可以避免采用对照药材的繁琐提取过程，溶解后直接使用；按照用途可分为用于配方颗粒用的对照提取物，即以水提取制备的对照物质，和用于代替对照药材的一般对照提取物，即全成分的对照物质。第2类对照提取物，根据原药材所含有效成分或活性成分的性质，研究具有选择性提取、纯化、重复性好的制备工艺，获得某类总成分的对照提取物。第3类对照提取物，制备工艺稳定，化学组成清晰，所含成分个数相对较少，主要用作多指标同步测定时混合对照品使用。第1， 2类对照提取物研制相对简单；第3类对照提取物不仅要求制备工艺稳定、具备可重复性，尚需对物质组成进行定性定量分析，对其定值进行准确标化。因此，本文以木通皂苷对照提取物为例，探讨中药质量评价定量用对照提取物的研究方法。
2 基于木通皂苷探讨对照提取物研究
, http://www.100md.com
木通为木通科植物木通Akebia quinata (Thunb.) Decne，三叶木通A. trifoliata (Thunb.) Koidz或白木通A. trifoliata(Thunb.)Koidz. var. australis (Diels) Rehd.的干燥藤茎，化学研究表明其化学成分主要为苯乙醇苷类和三萜皂苷类。2010年版《中国药典》收载了以木通苯乙醇B为对照品的定性定量分析[2]，尚缺乏皂苷类评价指标用于药材及中成药的质量控制。本研究针对含3个化学结构相似、性质相近、极难纯化的木通皂苷对照提取物进行探索研究，为木通药材及其中成药多指标质量控制提供新形式的对照物质，或可为其他定量用对照提取物的研制提供可借鉴的思路和方法。
2.1 仪器与试药
岛津LC20A高效液相系统(日本岛津公司)，配备四元泵、自动进样器、在线脱气机和二极管阵列检测器；安捷伦6320高效液相质谱联用仪(安捷伦公司)，配备电喷雾离子源和离子阱质谱检测器；HPD100大孔吸附树脂(河北沧州)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂分厂)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)；反相色谱硅胶(Fuji Silysia Chemical， Japan)；白木通皂苷B，木通皂苷PJ1和白木通皂苷C对照品由本实验室分离纯化并鉴定结构，纯度>98%(HPLC面积归一化法)；甲醇、乙腈(色谱级，德国fisher公司)，娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
分离用白木通药材采于四川，为木通科木通属植物白木通A. trifoliate var. australis的干燥藤茎。
2.2 方法与结果
2.2.1 木通皂苷对照提取物的制备 白木通药材1 kg，分别用10，10，8倍量沸水煎煮3次，每次1 h，滤过，合并煎煮液，静置过夜，离心(3 500 r·min-1，20 min)，上清液过HPD100大孔吸附树脂柱，依次用10倍柱体积的水，30%，50%，70% ，95%乙醇洗脱，收集含目标成分的50%乙醇洗脱液，减压干燥，计算得率(半制备组分Ⅰ)。50%乙醇洗脱部位甲醇溶解，滤除不溶性杂质，滤液硅胶拌样，进行硅胶减压柱色谱(200～300目)，氯仿甲醇水(15∶6∶1)等度洗脱，合并第3～5 倍柱体积的洗脱液，干燥，称重，计算粗品得率(半制备组分Ⅱ)。粗品经ODSC18柱色谱纯化，得木通皂苷对照提取物，计算得率(半制备组分Ⅲ)。重复上述工艺制备3批样品，各批次样品得率见表1。, 百拇医药(袁贤达 高慧敏 王智民 张启伟)