PEG化葛根素在不同贮藏条件下的稳定性研究(1)
[摘要] 目的： 考察聚乙二醇(PEG)化葛根素的稳定性，为PEG化葛根素贮藏条件提供实验依据。方法：首先建立PEG化葛根素的含量测定方法，再采用不同温度、湿度，光照和避光等影响因素对PEG化葛根素的稳定性进行系统研究。结果：PEG化葛根素在温度较高，湿度较大，光照条件下降解严重，尤其在光照条件下，其降解现象非常显著，其次为温度。结论：PEG化葛根素贮藏需采用低温冷藏、避光并干燥的环境。
[关键词] PEG化葛根素；葛根素；稳定性；降解率
葛根素(puerarin，PUE)是从豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi 或甘葛藤P.thomsonii Benth.干燥根中提取的单体。临床上葛根素注射剂常用来治疗和预防冠心病、心绞痛、心肌梗死等多种心脑血管疾病[1-4]。虽然其临床应用十分广阔，但存在水溶性差、半衰期短、急性血管内溶血等系列问题。本研究前期结果表明，聚乙二醇化葛根素(PEG化葛根素)可使葛根素上述问题很大程度上改善，但该药物稳定性如何，贮存条件如何，目前国内外尚缺乏PEG化药物相关的文献报道。作者参照《新药审批办法——药物稳定性试验指导原则》中稳定性试验项下的要求，结合相关文献报道[5]，设计了有关贮藏条件影响因素的稳定性试验，考察PEG化葛根素含量在温度、湿度、光照影响下随时间变化的规律，为PEG化葛根素的生产、包装、贮存、运输条件等提供科学依据，同时也可为药物有效期的预测提供一些技术性参考。
, 百拇医药
1 材料
Aglient 1200 HPLC(美国安捷伦科技有限公司)，FB-127电子分析天平(长沙圣凡仪器设备有限公司)，RTOP-500B光照箱(浙江托普仪器有限公司)，1020-STH恒温恒湿试验箱(广州斯派克环境仪器有限公司)，PEG化葛根素(葛根素质量分数为4.01%，相对分子质量5 100，纯度为98%，本实验室合成)，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[6]
Capcell Pak C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)；流动相0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～6 min，87% A；6～7 min，87%～60% A；7～12 min，60%～40% A；12～14 min，40%～87% A；14～17 min，87% A。流速1 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长250 nm。
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2.2 方法学考察
2.2.1 方法专属性 精密称取PEG化葛根素适量，以丙二醇-醋酸缓冲液(pH 4.8)(50 ∶ 50)为溶剂，配制PEG化葛根素溶液，以配置溶剂作为空白对照，按2.1项色谱条件将PEG化葛根素溶液和空白对照溶剂同时进样。发现该溶剂系统和色谱条件对PEG化葛根素的检测无干扰，表明该方法的专属性良好，结果见图 1。
2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取PEG化葛根素适量，用甲醇配制成质量浓度为1 g·L-1的对照品溶液，依次用丙二醇-醋酸缓冲液(pH 4.8)(50 ∶ 50) 倍半稀释成系列浓度的溶液， PEG化葛根素质量浓度为1 000，500，250，125，62.5，31.3，15.7，8 mg·L-1。按2.1项色谱条件依次进样分析，以PEG化葛根素溶液的浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。PEG化葛根素回归方程分别为Y =1 387.4X + 2.486，r=0.999 9，线性范围8～1 000 mg·L-1，峰面积积分值与浓度具有良好的线性关系。
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2.2.3 精密度与准确度的测定 制备高、中、低3个浓度的PEG化葛根素溶液，处理方法同上。在同1天内各浓度样品平行制备5份，测定日内精密度和准确度；连续3 d制备同样的高、中、低3个浓度的PEG化葛根素溶液，分别每天进样，连续3 d，测定日间精密度和准确度，结果见表1，方法的准确度和精确度良好，基本达到了分析的要求。
2.2.4 稳定性试验 取质量浓度为 62.5 mg·L-1的PEG化葛根素，采用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别在0，2，4，6，8，10 h进样测定，峰面积的RSD 2.8%，表明PEG化葛根素溶液在10 h 内稳定性良好。
2.3 影响因素考察
2.3.1 温度的考察 参照《中国药典》2010年版附录ⅪⅩ C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则进行温度考察研究。精密称取PEG化葛根素适量置称量瓶中，摊成≤5 mm厚的薄层。分别于-20，0，25，40 ℃条件下放置，于10，20，30，40，50，60 d取样检测，与0 d进行比较，每组试验平行2份，结果见表2。参照2.2项方法学考察测定剩余PEG化葛根素的含量，除以最初的含量即为剩余率，再以时间天数为X轴，组数(不同温度)为Y轴，PEG化葛根素的降解率[降解率=100%-剩余率(%)]为Z轴，绘制三维曲线图，见图2。
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由图2结果分析，PEG化葛根素在低温条件下比较稳定，当环境温度为常温或继续升高时，PEG化葛根素的降解率开始增大，尤其在较高温度条件下，降解现象尤为明显，提示PEG化葛根素在低温冷冻条件下保存比较合适。
2.3.2 湿度的考察 参照《中国药典》2010年版附录ⅪⅩ C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则进行湿度考察研究。精密称取PEG化葛根素适量置称量瓶中，摊成≤5 mm厚的薄层。于25 ℃，RH (92.5 ± 5)%和25 ℃，RH (75 ± 5)%下放置10，20，30，40，50，60 d取样检测，同法检测PEG化葛根素的含量，然后与0 d进行比较。两者相减即为PEG化葛根素的降解率(%)，每组试验平行3份，结果见表3。以时间天数为X轴，组数(不同湿度)为Y轴，PEG化葛根素的降解率(%)为Z轴，绘制三维曲线图，见图3。, 百拇医药(刘新义 向大雄 李健和 胡雄彬 叶祖光)
[关键词] PEG化葛根素；葛根素；稳定性；降解率
葛根素(puerarin，PUE)是从豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi 或甘葛藤P.thomsonii Benth.干燥根中提取的单体。临床上葛根素注射剂常用来治疗和预防冠心病、心绞痛、心肌梗死等多种心脑血管疾病[1-4]。虽然其临床应用十分广阔，但存在水溶性差、半衰期短、急性血管内溶血等系列问题。本研究前期结果表明，聚乙二醇化葛根素(PEG化葛根素)可使葛根素上述问题很大程度上改善，但该药物稳定性如何，贮存条件如何，目前国内外尚缺乏PEG化药物相关的文献报道。作者参照《新药审批办法——药物稳定性试验指导原则》中稳定性试验项下的要求，结合相关文献报道[5]，设计了有关贮藏条件影响因素的稳定性试验，考察PEG化葛根素含量在温度、湿度、光照影响下随时间变化的规律，为PEG化葛根素的生产、包装、贮存、运输条件等提供科学依据，同时也可为药物有效期的预测提供一些技术性参考。
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1 材料
Aglient 1200 HPLC(美国安捷伦科技有限公司)，FB-127电子分析天平(长沙圣凡仪器设备有限公司)，RTOP-500B光照箱(浙江托普仪器有限公司)，1020-STH恒温恒湿试验箱(广州斯派克环境仪器有限公司)，PEG化葛根素(葛根素质量分数为4.01%，相对分子质量5 100，纯度为98%，本实验室合成)，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[6]
Capcell Pak C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)；流动相0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～6 min，87% A；6～7 min，87%～60% A；7～12 min，60%～40% A；12～14 min，40%～87% A；14～17 min，87% A。流速1 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长250 nm。
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2.2 方法学考察
2.2.1 方法专属性 精密称取PEG化葛根素适量，以丙二醇-醋酸缓冲液(pH 4.8)(50 ∶ 50)为溶剂，配制PEG化葛根素溶液，以配置溶剂作为空白对照，按2.1项色谱条件将PEG化葛根素溶液和空白对照溶剂同时进样。发现该溶剂系统和色谱条件对PEG化葛根素的检测无干扰，表明该方法的专属性良好，结果见图 1。
2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取PEG化葛根素适量，用甲醇配制成质量浓度为1 g·L-1的对照品溶液，依次用丙二醇-醋酸缓冲液(pH 4.8)(50 ∶ 50) 倍半稀释成系列浓度的溶液， PEG化葛根素质量浓度为1 000，500，250，125，62.5，31.3，15.7，8 mg·L-1。按2.1项色谱条件依次进样分析，以PEG化葛根素溶液的浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。PEG化葛根素回归方程分别为Y =1 387.4X + 2.486，r=0.999 9，线性范围8～1 000 mg·L-1，峰面积积分值与浓度具有良好的线性关系。
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2.2.3 精密度与准确度的测定 制备高、中、低3个浓度的PEG化葛根素溶液，处理方法同上。在同1天内各浓度样品平行制备5份，测定日内精密度和准确度；连续3 d制备同样的高、中、低3个浓度的PEG化葛根素溶液，分别每天进样，连续3 d，测定日间精密度和准确度，结果见表1，方法的准确度和精确度良好，基本达到了分析的要求。
2.2.4 稳定性试验 取质量浓度为 62.5 mg·L-1的PEG化葛根素，采用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别在0，2，4，6，8，10 h进样测定，峰面积的RSD 2.8%，表明PEG化葛根素溶液在10 h 内稳定性良好。
2.3 影响因素考察
2.3.1 温度的考察 参照《中国药典》2010年版附录ⅪⅩ C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则进行温度考察研究。精密称取PEG化葛根素适量置称量瓶中，摊成≤5 mm厚的薄层。分别于-20，0，25，40 ℃条件下放置，于10，20，30，40，50，60 d取样检测，与0 d进行比较，每组试验平行2份，结果见表2。参照2.2项方法学考察测定剩余PEG化葛根素的含量，除以最初的含量即为剩余率，再以时间天数为X轴，组数(不同温度)为Y轴，PEG化葛根素的降解率[降解率=100%-剩余率(%)]为Z轴，绘制三维曲线图，见图2。
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由图2结果分析，PEG化葛根素在低温条件下比较稳定，当环境温度为常温或继续升高时，PEG化葛根素的降解率开始增大，尤其在较高温度条件下，降解现象尤为明显，提示PEG化葛根素在低温冷冻条件下保存比较合适。
2.3.2 湿度的考察 参照《中国药典》2010年版附录ⅪⅩ C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则进行湿度考察研究。精密称取PEG化葛根素适量置称量瓶中，摊成≤5 mm厚的薄层。于25 ℃，RH (92.5 ± 5)%和25 ℃，RH (75 ± 5)%下放置10，20，30，40，50，60 d取样检测，同法检测PEG化葛根素的含量，然后与0 d进行比较。两者相减即为PEG化葛根素的降解率(%)，每组试验平行3份，结果见表3。以时间天数为X轴，组数(不同湿度)为Y轴，PEG化葛根素的降解率(%)为Z轴，绘制三维曲线图，见图3。, 百拇医药(刘新义 向大雄 李健和 胡雄彬 叶祖光)