铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析(3)
3.2 均一化处理cDNA及效果分析传统合成的cDNA未经均一化处理,其文库存在高丰度转录基因的克隆数量过多现象。在本研究中,cDNA分别经1×DSN,1/2×DSN,1/4×DSN均一化处理,第1次PCR扩增检测发现,1/4×DSN 均一化处理后,中间较亮的条带消失明显,呈现一条均匀的弥散条带(图 2),表明高丰度表达的基因丰度明显下降。但是2 kb以上片段较均一化前有所减少,这种现象在其他文献中也有报道[15]。因此,选取1/4×DSN的cDNA进行第2次PCR放大,检测结果同样显示扩增条带均匀弥散,而且扩增产物的含量明显增加(图 2),可以用于建库。亲环蛋白(cyclophilin)是一种高度保守的胞质蛋白,广泛存在并且大量表达于各种组织,参与多种信号转导途径,属于高丰度转录基因[18]。为了进一步确定DSN均一化的效率,分别以已1/4×DSN处理和未均一化的cDNA(即对照) 为模板,对亲环蛋白基因进行PCR检测,由于两模板使用相同量的起始cDNA,处理过程也一致,因此可保证结果的准确性 ......
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