多指标正交试验优化菊花提取工艺(1)
[摘要] 目的：通过正交试验设计，探索量化的菊花评价指标，对菊花的提取工艺进行优化。方法：选择乙醇浓度、乙醇倍数、提取时间、提取次数4个因素，采用L9(34)安排试验，以菊花指纹图谱中8个主要共有峰的峰面积和浸出物含量作为指标，进行综合评价。结果：优选出菊花最佳提取工艺，采用超声波提取法，加入30倍80%乙醇溶液，提取40 min，共2次。结论：优化的提取工艺结果可靠，评价指标可控，对于规范菊花的提取工艺和菊花饮片的质量控制具有一定的意义。
[关键词] 菊花；正交试验；指纹图谱；多指标；提取工艺
菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序，具散风清热，平肝明目，清热解毒之功效，用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等[1]。2010年版《中国药典》中测定项下规定绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸(异绿原酸A)为其质量控制指标性成分。由于中药化学成分的组成和治疗机制较复杂，因此本试验采用菊花指纹图谱中8个主要共有峰的峰面积(包括药典中3个指标性成分)和浸出物含量为指标，采用正交设计方法优选菊花最佳提取工艺，为菊花原料的选择和菊花饮片的质量检测提供参考。
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1材料
Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统(日本岛津公司，包括在线脱气机、Prominence SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱)；电子天平(BS2242S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(瑞士步琪)。
绿原酸、异绿原酸A、木犀草素、木犀草苷、槲皮素均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-200413，111782-200801，111520-200504，111720-200905，100081-200406；芹菜素(111901-201001)购自上海抚生实业有限公司；芹菜素苷、刺槐素购自南京泽朗医药有限公司，批号为ZL120513GR，ZL120506P。甲醇、磷酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，美国天地公司)。菊花为购自安徽惠隆中药饮片有限公司的白菊花，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为菊科植物菊C. morifolium的干燥头状花序。
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2方法与结果
2.1试验设计 采用正交试验法对菊花药材提取工艺进行优选。以溶剂浓度(A)、溶剂倍数(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，每个因素选取3个水平，以菊花中8个指标性成分的峰面积和浸出物含量为评价指标。因素水平见表1。
2.2HPLC的建立
2.2.1供试品溶液的制备 取菊花药材1 g，精密称定相同的9份，根据L9(34)正交试验设计表采用超声波提取法进行提取，滤过，所得提取液分别以相应的提取溶剂定容至200 mL作为样品溶液。精密移取样品溶液100 mL，回收溶剂，残渣用80%甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得各提取液的供试液。
2.2.2色谱条件 Dikma Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，0～10 min，2%～10%乙腈，10～48 min，20%～26%乙腈，48～100 min，26%～35%乙腈，流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃，检测波长351 nm，进样量20 μL。对照品和样品的色谱图见图1。
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2.2.3精密度试验 取菊花粉末1 g，精密称定，按2.2.1项下方法制备供试液，重复进样6次，记录HPLC图。结果表明，以绿原酸为参照物，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.36%，相对峰面积的RSD均小于1.6%。
2.2.4稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，24 h进行色谱分析。结果表明，以绿原酸为参照物，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.39%，相对峰面积的RSD均小于2.3%。
2.2.5重复性试验 取同批菊花粉末6份，每份1 g，同法制备供试液，重复进样6次，记录HPLC图。结果表明，以绿原酸为参照物，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.48%，相对峰面积的RSD均小于2.7%。
2.3浸出物含量的测定
精密移取2.2.1项下样品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。
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2.4正交试验方案及结果
选择L9(34)表，试验方案及结果见表2，3。由于本次正交设计采用了多个指标成分进行分析，所以采用多指标试验公式法[2]进行数据处理。以Xij表示第i次试验第j个指标的测定值(即Xij表示正交试验的第i次试验的色谱图中第j个色谱峰峰面积)，首先以各指标的最大值作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据。Dij=Xij/(Xj)max，其中i=1，2，…9；j=1，2，…，8。再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准偏差确定权重系数，Fj=Ej×RSD/RSDj，其中RSD为绿原酸的相对标准偏差，RSDj为第j个指标的相对标准差，由于各指标的药效不是非常明确而且峰面积都较大，故认为都很重要，重要程度Ej均定为1。Pi= Σ(Fj×Dij)/ΣFj，计算所得的兼顾各项指标综合评分公式Pi越大越好，数据处理结果见表4，5。, http://www.100md.com(张星海 李嬛 秦昆明 刘晓 汪斌 蔡宝昌)
[关键词] 菊花；正交试验；指纹图谱；多指标；提取工艺
菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序，具散风清热，平肝明目，清热解毒之功效，用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等[1]。2010年版《中国药典》中测定项下规定绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸(异绿原酸A)为其质量控制指标性成分。由于中药化学成分的组成和治疗机制较复杂，因此本试验采用菊花指纹图谱中8个主要共有峰的峰面积(包括药典中3个指标性成分)和浸出物含量为指标，采用正交设计方法优选菊花最佳提取工艺，为菊花原料的选择和菊花饮片的质量检测提供参考。
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1材料
Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统(日本岛津公司，包括在线脱气机、Prominence SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱)；电子天平(BS2242S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(瑞士步琪)。
绿原酸、异绿原酸A、木犀草素、木犀草苷、槲皮素均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-200413，111782-200801，111520-200504，111720-200905，100081-200406；芹菜素(111901-201001)购自上海抚生实业有限公司；芹菜素苷、刺槐素购自南京泽朗医药有限公司，批号为ZL120513GR，ZL120506P。甲醇、磷酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，美国天地公司)。菊花为购自安徽惠隆中药饮片有限公司的白菊花，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为菊科植物菊C. morifolium的干燥头状花序。
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2方法与结果
2.1试验设计 采用正交试验法对菊花药材提取工艺进行优选。以溶剂浓度(A)、溶剂倍数(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，每个因素选取3个水平，以菊花中8个指标性成分的峰面积和浸出物含量为评价指标。因素水平见表1。
2.2HPLC的建立
2.2.1供试品溶液的制备 取菊花药材1 g，精密称定相同的9份，根据L9(34)正交试验设计表采用超声波提取法进行提取，滤过，所得提取液分别以相应的提取溶剂定容至200 mL作为样品溶液。精密移取样品溶液100 mL，回收溶剂，残渣用80%甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得各提取液的供试液。
2.2.2色谱条件 Dikma Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，0～10 min，2%～10%乙腈，10～48 min，20%～26%乙腈，48～100 min，26%～35%乙腈，流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃，检测波长351 nm，进样量20 μL。对照品和样品的色谱图见图1。
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2.2.3精密度试验 取菊花粉末1 g，精密称定，按2.2.1项下方法制备供试液，重复进样6次，记录HPLC图。结果表明，以绿原酸为参照物，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.36%，相对峰面积的RSD均小于1.6%。
2.2.4稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，24 h进行色谱分析。结果表明，以绿原酸为参照物，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.39%，相对峰面积的RSD均小于2.3%。
2.2.5重复性试验 取同批菊花粉末6份，每份1 g，同法制备供试液，重复进样6次，记录HPLC图。结果表明，以绿原酸为参照物，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.48%，相对峰面积的RSD均小于2.7%。
2.3浸出物含量的测定
精密移取2.2.1项下样品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。
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2.4正交试验方案及结果
选择L9(34)表，试验方案及结果见表2，3。由于本次正交设计采用了多个指标成分进行分析，所以采用多指标试验公式法[2]进行数据处理。以Xij表示第i次试验第j个指标的测定值(即Xij表示正交试验的第i次试验的色谱图中第j个色谱峰峰面积)，首先以各指标的最大值作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据。Dij=Xij/(Xj)max，其中i=1，2，…9；j=1，2，…，8。再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准偏差确定权重系数，Fj=Ej×RSD/RSDj，其中RSD为绿原酸的相对标准偏差，RSDj为第j个指标的相对标准差，由于各指标的药效不是非常明确而且峰面积都较大，故认为都很重要，重要程度Ej均定为1。Pi= Σ(Fj×Dij)/ΣFj，计算所得的兼顾各项指标综合评分公式Pi越大越好，数据处理结果见表4，5。, http://www.100md.com(张星海 李嬛 秦昆明 刘晓 汪斌 蔡宝昌)