COI基因的龟甲及其混伪品的DNA条形码研究> 基于COI基因的龟甲及其混伪品的DNA条形码(1)
[摘要] 目的：利用COI基因对乌龟及常见混伪品进行分子鉴定，探讨快速、准确鉴定龟甲及其混伪品的方法。
方法：在全国范围内收集龟甲的正品及其混伪品8种，共22份样品，提取DNA，得到其COI序列。用Contig Express，Dnaman，Edit Sequence，Mega 5 等软件进行变异位点分析，并构建正品龟甲其混伪品的N，J 树。
结果：龟甲的正品来源乌龟与其混伪品种间存在较多变异位点。由所构建的系统聚类树图可以看出，同属聚在一起，且各物种又形成相对独立的支。
结论： 基于COI 序列的DNA 条形码技术可以很好地鉴定龟甲及其混伪品。
[关键词]龟甲；COI序列；DNA 条形码
龟甲为常见动物类药材，《中国药典》2010年版规定爬行纲龟科动物乌龟Chinemys reevesii(Gray)的腹甲和背甲，具滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效[1]。但是在药材市场上，龟甲的来源确十分的混乱，主要以巴西龟的背甲、腹甲居多，另外还有部分的缅甸陆龟、黄喉拟水龟、地龟、平胸龟等。
, http://www.100md.com
近几年，随着如龟苓膏、黄金酒、鹿龟酒等龟甲的相关产品的开发，其需求量增长迅速。因此，保护龟甲的优秀种质资源、防止混伪品充斥市场就成了保证龟甲药材及其相关产品质量的重中之重。
DNA 条形码技术是近来发展起来的物种鉴定新方法，通过对基因组中一段短的、标准的DNA 片段进行分析从而对物种进行准确鉴定，成为生物分类和鉴定的研究热点和方向。尤其适用于来源于生物体部分组织或器官的中药材的真伪鉴定[2，3]。2003年， PDN 等[4]对动物界11 个门13 320个物种的研究结果显示， 线粒体COI基因对动物界刺胞动物门以外的物种存在显著的序列变异， 并能够进行有效的鉴定。国内尚无利用COI序列来鉴定龟甲与其混伪品的相关报道。本文主要考察全国龟类的主要产区的代表群体为研究对象，通过建立快速有效的DNA提取、PCR扩增方法，测定COI基因序列，比较其序列特征。考察利用COI序列鉴别龟甲与其混伪品的可行性。
1 材料
, 百拇医药
1.1 样品 收集我国9个省区的23份龟类的种群种质资源，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，其中8份为野生品种，14其余为人工养殖品种，1份为药材(为花龟)。样品收集情况见表1。
1.2 仪器 离心机(Sigma 3K15)；PCR仪(TECHNE TC，3000)；超低温冰箱(SANYE -80 ℃)；电泳仪(BIO RAD)；电泳槽(君慧东方 JY，SPDT)；凝胶成像分析仪(培清科技 JS，68DB)。
1.3 试药 上海生工生物UNIQ，10动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK1205；Ezup动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK8251；无水乙醇(北京化工公司，分析纯)；Taq酶反应体系(Takara DR001AM)；2ΧPCRTaqMIX体系(美莱博公司2XPCRTaqMix)；引物LCO2198，LCO1490由上海生工生物合成。
2 方法
, http://www.100md.com
2.1 模板DNA的提取 取活体或冻存的龟类肌肉组织0.2 g，采用试剂盒法提取总DNA，DNA试剂盒为Ezup动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK8251。龟甲药材采用上海生工生物UNIQ，10动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK1205。
2.2 PCR引物 采用COI基因通用引物 LCOI490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)，LCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)进行PCR扩增，引物由上海生工负责合成。
2.3 PCR 扩增反应条件及鉴定 扩增反应在TECHNE TC，3000热循环仪上进行，反应体系50 μL，包涵2 U Taq DNA polymerase，2 mmol·L-1 MgCl2，2 mmol·L-1 dNTP，2.5 mmol·L-1 PCR buffer，上下游引物各0.2 pmol·L-1，模板25 ng，超纯水补至50 μL。由于COI 基因长度小于750 bp，因此，可以使用Taq mix酶进行扩增和后续实验，Taq mix反应体系为50 μL，包涵25 mmol·L-1Taq mix，上下游引物各0.6 pmol·L-1，DNA模板25 ng，超纯水补至50 μL。扩增条件为94 ℃ 预变性 7 min，94 ℃ 变性 1 min，45～47 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环40次，72 ℃ 再延伸 10 min。用鉴别引物对正品和其他伪品原动物进行高特异性PCR 鉴别时，PCR 反应参数中选用不同的复性温度，进行PCR 循环，以寻找合适的鉴别PCR 条件。
龟甲药材采用Taq酶反应体系，包涵2 U Taq DNA polymerase，2 mmol·L-1 MgCl2，2mmol·L-1 dNTP，2.5 mmol·L-1 PCR buffer，上下游引物各0.2 pmol·L-1，模板25 ng，超纯水补至50 μL。94 ℃ 变性 1 min，45 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环40次，72 ℃ 再延伸 10 min。
实验中设置不加模板DNA 的阴性对照，阳性对照的引物为LCO1490，LCO2198。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，用GIS 凝胶成像检测, 百拇医药(刘晓帆 刘春生 杨瑶珺 李军德 徐佳 吴立洁 戴待 刘杰)
方法：在全国范围内收集龟甲的正品及其混伪品8种，共22份样品，提取DNA，得到其COI序列。用Contig Express，Dnaman，Edit Sequence，Mega 5 等软件进行变异位点分析，并构建正品龟甲其混伪品的N，J 树。
结果：龟甲的正品来源乌龟与其混伪品种间存在较多变异位点。由所构建的系统聚类树图可以看出，同属聚在一起，且各物种又形成相对独立的支。
结论： 基于COI 序列的DNA 条形码技术可以很好地鉴定龟甲及其混伪品。
[关键词]龟甲；COI序列；DNA 条形码
龟甲为常见动物类药材，《中国药典》2010年版规定爬行纲龟科动物乌龟Chinemys reevesii(Gray)的腹甲和背甲，具滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效[1]。但是在药材市场上，龟甲的来源确十分的混乱，主要以巴西龟的背甲、腹甲居多，另外还有部分的缅甸陆龟、黄喉拟水龟、地龟、平胸龟等。
, http://www.100md.com
近几年，随着如龟苓膏、黄金酒、鹿龟酒等龟甲的相关产品的开发，其需求量增长迅速。因此，保护龟甲的优秀种质资源、防止混伪品充斥市场就成了保证龟甲药材及其相关产品质量的重中之重。
DNA 条形码技术是近来发展起来的物种鉴定新方法，通过对基因组中一段短的、标准的DNA 片段进行分析从而对物种进行准确鉴定，成为生物分类和鉴定的研究热点和方向。尤其适用于来源于生物体部分组织或器官的中药材的真伪鉴定[2，3]。2003年， PDN 等[4]对动物界11 个门13 320个物种的研究结果显示， 线粒体COI基因对动物界刺胞动物门以外的物种存在显著的序列变异， 并能够进行有效的鉴定。国内尚无利用COI序列来鉴定龟甲与其混伪品的相关报道。本文主要考察全国龟类的主要产区的代表群体为研究对象，通过建立快速有效的DNA提取、PCR扩增方法，测定COI基因序列，比较其序列特征。考察利用COI序列鉴别龟甲与其混伪品的可行性。
1 材料
, 百拇医药
1.1 样品 收集我国9个省区的23份龟类的种群种质资源，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，其中8份为野生品种，14其余为人工养殖品种，1份为药材(为花龟)。样品收集情况见表1。
1.2 仪器 离心机(Sigma 3K15)；PCR仪(TECHNE TC，3000)；超低温冰箱(SANYE -80 ℃)；电泳仪(BIO RAD)；电泳槽(君慧东方 JY，SPDT)；凝胶成像分析仪(培清科技 JS，68DB)。
1.3 试药 上海生工生物UNIQ，10动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK1205；Ezup动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK8251；无水乙醇(北京化工公司，分析纯)；Taq酶反应体系(Takara DR001AM)；2ΧPCRTaqMIX体系(美莱博公司2XPCRTaqMix)；引物LCO2198，LCO1490由上海生工生物合成。
2 方法
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2.1 模板DNA的提取 取活体或冻存的龟类肌肉组织0.2 g，采用试剂盒法提取总DNA，DNA试剂盒为Ezup动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK8251。龟甲药材采用上海生工生物UNIQ，10动物基因组DNA抽试提取试剂盒SK1205。
2.2 PCR引物 采用COI基因通用引物 LCOI490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)，LCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)进行PCR扩增，引物由上海生工负责合成。
2.3 PCR 扩增反应条件及鉴定 扩增反应在TECHNE TC，3000热循环仪上进行，反应体系50 μL，包涵2 U Taq DNA polymerase，2 mmol·L-1 MgCl2，2 mmol·L-1 dNTP，2.5 mmol·L-1 PCR buffer，上下游引物各0.2 pmol·L-1，模板25 ng，超纯水补至50 μL。由于COI 基因长度小于750 bp，因此，可以使用Taq mix酶进行扩增和后续实验，Taq mix反应体系为50 μL，包涵25 mmol·L-1Taq mix，上下游引物各0.6 pmol·L-1，DNA模板25 ng，超纯水补至50 μL。扩增条件为94 ℃ 预变性 7 min，94 ℃ 变性 1 min，45～47 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环40次，72 ℃ 再延伸 10 min。用鉴别引物对正品和其他伪品原动物进行高特异性PCR 鉴别时，PCR 反应参数中选用不同的复性温度，进行PCR 循环，以寻找合适的鉴别PCR 条件。
龟甲药材采用Taq酶反应体系，包涵2 U Taq DNA polymerase，2 mmol·L-1 MgCl2，2mmol·L-1 dNTP，2.5 mmol·L-1 PCR buffer，上下游引物各0.2 pmol·L-1，模板25 ng，超纯水补至50 μL。94 ℃ 变性 1 min，45 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环40次，72 ℃ 再延伸 10 min。
实验中设置不加模板DNA 的阴性对照，阳性对照的引物为LCO1490，LCO2198。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，用GIS 凝胶成像检测, 百拇医药(刘晓帆 刘春生 杨瑶珺 李军德 徐佳 吴立洁 戴待 刘杰)