1.2 总RNA提取与纯化

    按TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明对以上材料提取总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳(180 V，0.5 h)检测总RNA的28S和18S的比例；在260 nm/280 nm波长下测定总RNA的吸光值，并计算其浓度和纯度。根据RT，PCR(反转录)试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，美国)进行cDNA合成。

    1.3 头茬和重茬差异表达基因的获取

    1.3.1 转录组文库构建 选取块根膨大前期^[13]地黄根部(R，包括头茬和连作的根等量均匀混合)及其叶片(L，包括头茬和连作的根等量均匀混合)RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以此为模板，用六碱基随机引物合成第1条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs，RNase H和DNA polymerase I合成第2条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择 ......