莪术醇抑制人肝癌细胞HepG2增殖的机制(1)
[摘要] 目的：探讨莪术醇在体外对人肝癌HepG2细胞的增殖和细胞周期的影响及其分子机制。方法：体外培养HepG2细胞，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察莪术醇对HepG2细胞增殖的抑制作用，流式细胞术分析莪术醇处理后HepG2细胞的周期分布，TaqMan探针实时荧光定量PCR法及Western印迹检测细胞周期调控相关基因的表达水平。结果：莪术醇对HepG2细胞的增殖具有明显抑制作用，且在一定范围内(2.5～10 mg·L-1)呈浓度和时间依赖性；莪术醇诱导 HepG2 细胞发生G1期阻滞，伴随 cyclin D1，CDK2，CDK8，pRB1，p27KIP1 mRNA 表达水平增高，而cyclin A1的水平则下调，cyclin E1和CDK4的表达不受影响，p53及其下游调控蛋白p21WAF1和Wip1表达水平增高。结论：莪术醇诱导人肝癌HepG2细胞G1期阻滞、抑制细胞增殖，其作用可能通过激活p53与pRB通路，抑制cyclin A1基因的表达和上调p21 WAF1，p27KIP1以及CDK8基因的表达而实现的。
, 百拇医药
[关键词]莪术醇；肝癌；肿瘤增殖；细胞周期阻滞
[稿件编号] 20121222004
[基金项目] 广西医学科学实验中心开放基金项目(KFJJ2011-13)
[通信作者] *蒋晓山，博士，研究员，E-mail：jiangxs@glmc.edu.cn
[作者简介] 黄岚珍，E-mail：huanglzh@126.com
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，病程进展快，手术切除率低，对常规放化疗手段缺乏敏感，病死率高。因此，寻找新的抗肝癌治疗药物意义重大。莪术醇，又名姜黄环奥醇，是从中药莪术中分离得到的单体化合物。研究表明，莪术醇能够抑制人多种肿瘤细胞的增殖，其作用的分子机制尚未明了[1]。本研究在观察莪术醇对人肝癌HepG2细胞增殖影响的基础上，检测和分析了莪术醇对细胞周期及其相关调控基因表达的影响，为进一步探讨莪术醇抗肿瘤作用机制及其潜在的临床应用提供了新的理论依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药品与试剂 莪术醇(纯度≥98%，上海艾汇生物科技公司，批号 P02-03)溶于无水乙醇，贮存液 500 mg·L-1；四氮唑蓝(MTT，美国Amresco)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma)；碘化丙啶(PI，Sigma)；Trizol试剂和逆转录酶试剂盒(美国Invitrogen)；荧光定量PCR反应试剂盒及基因引物和探针合成(美国ABI)；鼠抗人 p53，p21，Wip1 及 β-actin 抗体(美国Santa Cruz)。
1.2 细胞株与细胞培养 人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞所(上海)细胞库，常规培养于体积分数10%胎牛血清(美国 HyClone)的RPMI1640(HyClone)培养液及含5%CO2 的37 ℃培养箱中，每3～4 d换液传代。
1.3仪器 CO2细胞培养箱(美国 NBS)；iMark型酶标仪(美国Bio-Rad)；FACSAriaⅢ流式细胞仪(美国BD)；7500Fast 实时荧光定量PCR仪(美国ABI)。
, 百拇医药
2 方法
2.1 MTT 比色法检测细胞增殖 将人肝癌HepG2细胞以4×103个/孔/100 μL接种于96 孔板。第2天分别加入不同浓度的莪术醇，等体积乙醇+培养液作为对照组，另设无细胞空白组，每组5个复孔。于预定时间分别加入MTT 10 μL/孔，培养4 h，离心弃上清液，加DMSO 200 μL/孔，振荡至沉淀完全溶解，酶标仪读取各孔在490 nm处的吸光度A，绘制细胞生长曲线，实验重复3次。
2.2 流式细胞术(FCM)检测细胞周期 细胞周期同步化：无血清的 PRMI 1640细胞培养基培养HepG2细胞 5 d，使大部分细胞停留在G1期。细胞周期检测：常规消化并计数同步化的HepG2细胞，以5×105 个/皿接种于Ф60 mm 培养皿，10 h后加入莪术醇及等体积乙醇(对照组)；分别于16，24，32 h收集细胞制成单细胞悬液，70%乙醇固定，1%RNA 酶处理、PI染色后上流式细胞仪检测(激发波长562 nm，发射波长 630 nm)细胞周期分布(DNA 含量)情况。实验重复3次。
, 百拇医药
2.3 实时荧光定量PCR检测细胞周期调控相关基因的表达 总RNA 提取及逆转录反应：收集细胞，按照Trizol说明书提取总RNA，然后按M-MLV逆转录酶试剂盒说明书步骤，逆转录成cDNA。
实时荧光定量PCR：将逆转录所得cDNA分别在不同的微量管中进行扩增，采用TaqMan基因探针，按照荧光定量PCR反应试剂盒操作手册配制20 μL反应体系；反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。结果根据标准曲线由软件自动计算后得出。
2.4 Western印迹 收集细胞，加入RIPA裂解缓冲液(150 mmol·L-1氯化纳，1.0% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，50 mmol·L-1Tris，pH 8.0，0.2 mg·L-1抑肽酶，0.5 mg·L-1亮抑蛋白肽酶，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟)裂解细胞，离心取上清，加入蛋白质上样缓冲液，100 ℃，5 min 变性，SDS-PAGE电泳，半干电转法将蛋白质转移至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h 后，分别用相应的一抗和HRP标记的二抗室温孵育 1 h，ECL化学发光法检测特异蛋白条带。, http://www.100md.com(黄岚珍,王娟,卢菲婷,杨飞城,陈旭,洪雪,蒋晓山)
, 百拇医药
[关键词]莪术醇；肝癌；肿瘤增殖；细胞周期阻滞
[稿件编号] 20121222004
[基金项目] 广西医学科学实验中心开放基金项目(KFJJ2011-13)
[通信作者] *蒋晓山，博士，研究员，E-mail：jiangxs@glmc.edu.cn
[作者简介] 黄岚珍，E-mail：huanglzh@126.com
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，病程进展快，手术切除率低，对常规放化疗手段缺乏敏感，病死率高。因此，寻找新的抗肝癌治疗药物意义重大。莪术醇，又名姜黄环奥醇，是从中药莪术中分离得到的单体化合物。研究表明，莪术醇能够抑制人多种肿瘤细胞的增殖，其作用的分子机制尚未明了[1]。本研究在观察莪术醇对人肝癌HepG2细胞增殖影响的基础上，检测和分析了莪术醇对细胞周期及其相关调控基因表达的影响，为进一步探讨莪术醇抗肿瘤作用机制及其潜在的临床应用提供了新的理论依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药品与试剂 莪术醇(纯度≥98%，上海艾汇生物科技公司，批号 P02-03)溶于无水乙醇，贮存液 500 mg·L-1；四氮唑蓝(MTT，美国Amresco)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma)；碘化丙啶(PI，Sigma)；Trizol试剂和逆转录酶试剂盒(美国Invitrogen)；荧光定量PCR反应试剂盒及基因引物和探针合成(美国ABI)；鼠抗人 p53，p21，Wip1 及 β-actin 抗体(美国Santa Cruz)。
1.2 细胞株与细胞培养 人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞所(上海)细胞库，常规培养于体积分数10%胎牛血清(美国 HyClone)的RPMI1640(HyClone)培养液及含5%CO2 的37 ℃培养箱中，每3～4 d换液传代。
1.3仪器 CO2细胞培养箱(美国 NBS)；iMark型酶标仪(美国Bio-Rad)；FACSAriaⅢ流式细胞仪(美国BD)；7500Fast 实时荧光定量PCR仪(美国ABI)。
, 百拇医药
2 方法
2.1 MTT 比色法检测细胞增殖 将人肝癌HepG2细胞以4×103个/孔/100 μL接种于96 孔板。第2天分别加入不同浓度的莪术醇，等体积乙醇+培养液作为对照组，另设无细胞空白组，每组5个复孔。于预定时间分别加入MTT 10 μL/孔，培养4 h，离心弃上清液，加DMSO 200 μL/孔，振荡至沉淀完全溶解，酶标仪读取各孔在490 nm处的吸光度A，绘制细胞生长曲线，实验重复3次。
2.2 流式细胞术(FCM)检测细胞周期 细胞周期同步化：无血清的 PRMI 1640细胞培养基培养HepG2细胞 5 d，使大部分细胞停留在G1期。细胞周期检测：常规消化并计数同步化的HepG2细胞，以5×105 个/皿接种于Ф60 mm 培养皿，10 h后加入莪术醇及等体积乙醇(对照组)；分别于16，24，32 h收集细胞制成单细胞悬液，70%乙醇固定，1%RNA 酶处理、PI染色后上流式细胞仪检测(激发波长562 nm，发射波长 630 nm)细胞周期分布(DNA 含量)情况。实验重复3次。
, 百拇医药
2.3 实时荧光定量PCR检测细胞周期调控相关基因的表达 总RNA 提取及逆转录反应：收集细胞，按照Trizol说明书提取总RNA，然后按M-MLV逆转录酶试剂盒说明书步骤，逆转录成cDNA。
实时荧光定量PCR：将逆转录所得cDNA分别在不同的微量管中进行扩增，采用TaqMan基因探针，按照荧光定量PCR反应试剂盒操作手册配制20 μL反应体系；反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。结果根据标准曲线由软件自动计算后得出。
2.4 Western印迹 收集细胞，加入RIPA裂解缓冲液(150 mmol·L-1氯化纳，1.0% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，50 mmol·L-1Tris，pH 8.0，0.2 mg·L-1抑肽酶，0.5 mg·L-1亮抑蛋白肽酶，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟)裂解细胞，离心取上清，加入蛋白质上样缓冲液，100 ℃，5 min 变性，SDS-PAGE电泳，半干电转法将蛋白质转移至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h 后，分别用相应的一抗和HRP标记的二抗室温孵育 1 h，ECL化学发光法检测特异蛋白条带。, http://www.100md.com(黄岚珍,王娟,卢菲婷,杨飞城,陈旭,洪雪,蒋晓山)