马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用(1)
摘要 目的： 体外探讨马尾松树皮提取物(PMBE)对顺铂所致肾毒性的保护作用，并初步探究其作用机制。方法： 体外培养人胚肾细胞HEK293，用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)方法分别检测PMBE、顺铂对HEK293细胞生长的影响，以及PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的保护作用；并检测各组细胞内的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量，以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和硫氧还蛋白酶(TrxR)的活性。结果： PMBE低浓度下促进HEK293细胞生长，较高浓度下对细胞产生轻微毒性；顺铂抑制HEK293细胞生长，使细胞内ROS，MDA含量升高，GSH含量降低，同时降低SOD，CAT和TrxR酶活性；加入PMBE预保护后，在一定范围内降低顺铂对HEK293细胞的损伤，降低ROS，MDA含量，升高GSH含量，以及提高SOD，CAT和TrxR酶活性。结论： 一定浓度的PMBE对顺铂所致人胚肾细胞的毒性有保护作用，其机制可能与PMBE的抗氧化性密切相关。
关键词 马尾松树皮提取物；顺铂；人胚肾细胞；肾毒性；抗氧化性
, 百拇医药
收稿日期 2013-01-16
基金项目 广东省工业攻关计划项目(2004b10401033)；广东省自然科学基金项目(S2012010010533)；中山大学教务处教改项目(100035)
通信作者 *王宏斌，教授，Tel：(020)84039179，E-mail：wanghb@mail.sysu.edu.cn
作者简介 冯冬茹，博士，E-mail：lssfdr@mail.sysu.edu.cn
顺铂是临床上广泛使用的化疗药物之一，但顺铂严重的肾毒性是限制其临床应用的主要因素，机制可能与其引起的过氧化反应有关[1-2]。近几年的研究表明，抗氧化剂对顺铂的肾毒害有明显的保护作用[3]。马尾松树皮提取物(Pinus massoniana bark extracts，PMBE)的主要活性成分是原花青素，由单体、寡聚体和多聚体等天然类黄酮组成的混合物[4]。本实验室已经证明马尾松树皮提取物具有抗氧化以及清除自由基的能力[5]，但是对其在顺铂肾毒性保护上的应用还未见报道，基于此，本研究以人胚肾细胞HEK293为研究材料，旨在重点研究PMBE是否对顺铂引起的肾毒性具有保护作用，并初步探究其作用机制。
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1 材料与方法
1.1 药物与试剂 马尾松树皮提取物(PMBE，由广东省嵩珍营养研究所提供，用DMSO配成100 g·L-1的贮存液，并用0.22 μm的过滤膜过滤，-20 ℃储存。使用前，用10% FBS-DMEM培养液配成不同浓度的处理液)；顺铂(TCI，日本东京化成工业株式会社，纯度>95.0%，用PBS配制溶解后用0.22 μm的过滤膜过滤，密封避光4 ℃保存备用)；人胚肾细胞HEK293(中山大学医学院动物细胞中心)；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM、青链霉素和维生素C(Vit C)(Gibco公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)和过氧化氢酶(catalase，CAT)检测试剂盒(碧云天公司)；NADPH和胰岛素(普博公司)；MTT，DTNB和小鼠肝脏TrxR(Sigma-Aldrich)；E. coli Trx为本实验室从质粒中分离纯化；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
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1.2 细胞培养 细胞用含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养液培养，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中，用0.25%胰蛋白酶消化传代，2～3 d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。
1.3 细胞存活率检测实验 顺铂对HEK293细胞的毒性作用：取对数期的细胞，消化后吹打成单细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板。待细胞生长至融合状态，加入不同浓度顺铂(终浓度分别为0，0.015，0.030，0.060，0.120，0.240，0.480，0.960，1.920，3.840 mmol·L-1)。培养24 h后，每孔加入5 g·L-1的无菌MTT溶液20 μL，继续培养4 h。弃去各孔的培养液，加入150 μL DMSO，200 r·min-1摇床振荡10 min。多功能酶标仪上测定490 nm吸光度(A)，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。细胞存活率 = A实验/ A空白对照× 100%。
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PMBE对HEK293细胞生长的影响：细胞处理方法同1.2项，待细胞生长至融合状态时，加入不同浓度的PMBE(终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1)，培养48 h后，同上用MTT法测定吸光度，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。
PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的保护作用：同1.2项，用不同浓度的PMBE培养24 h，弃去处理液，再加入半抑制浓度(IC50)的顺铂处理24 h。用MTT法测定吸光度，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。
1.4 各氧化指标检测 取对数期的细胞以1×105个/mL的浓度接种于6孔板，待细胞生长至融合后，加入不同浓度的PMBE(终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1)以及Vit C(100 mg·L-1)培养24 h，弃去处理液，再加入半抑制浓度的顺铂处理24 h。, http://www.100md.com(冯冬茹 戴青辰 谢衡 李若达 郑光耀 王金发 王宏斌)
关键词 马尾松树皮提取物；顺铂；人胚肾细胞；肾毒性；抗氧化性
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收稿日期 2013-01-16
基金项目 广东省工业攻关计划项目(2004b10401033)；广东省自然科学基金项目(S2012010010533)；中山大学教务处教改项目(100035)
通信作者 *王宏斌，教授，Tel：(020)84039179，E-mail：wanghb@mail.sysu.edu.cn
作者简介 冯冬茹，博士，E-mail：lssfdr@mail.sysu.edu.cn
顺铂是临床上广泛使用的化疗药物之一，但顺铂严重的肾毒性是限制其临床应用的主要因素，机制可能与其引起的过氧化反应有关[1-2]。近几年的研究表明，抗氧化剂对顺铂的肾毒害有明显的保护作用[3]。马尾松树皮提取物(Pinus massoniana bark extracts，PMBE)的主要活性成分是原花青素，由单体、寡聚体和多聚体等天然类黄酮组成的混合物[4]。本实验室已经证明马尾松树皮提取物具有抗氧化以及清除自由基的能力[5]，但是对其在顺铂肾毒性保护上的应用还未见报道，基于此，本研究以人胚肾细胞HEK293为研究材料，旨在重点研究PMBE是否对顺铂引起的肾毒性具有保护作用，并初步探究其作用机制。
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1 材料与方法
1.1 药物与试剂 马尾松树皮提取物(PMBE，由广东省嵩珍营养研究所提供，用DMSO配成100 g·L-1的贮存液，并用0.22 μm的过滤膜过滤，-20 ℃储存。使用前，用10% FBS-DMEM培养液配成不同浓度的处理液)；顺铂(TCI，日本东京化成工业株式会社，纯度>95.0%，用PBS配制溶解后用0.22 μm的过滤膜过滤，密封避光4 ℃保存备用)；人胚肾细胞HEK293(中山大学医学院动物细胞中心)；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM、青链霉素和维生素C(Vit C)(Gibco公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)和过氧化氢酶(catalase，CAT)检测试剂盒(碧云天公司)；NADPH和胰岛素(普博公司)；MTT，DTNB和小鼠肝脏TrxR(Sigma-Aldrich)；E. coli Trx为本实验室从质粒中分离纯化；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
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1.2 细胞培养 细胞用含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养液培养，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中，用0.25%胰蛋白酶消化传代，2～3 d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。
1.3 细胞存活率检测实验 顺铂对HEK293细胞的毒性作用：取对数期的细胞，消化后吹打成单细胞悬液，以1×105个/mL接种于96孔板。待细胞生长至融合状态，加入不同浓度顺铂(终浓度分别为0，0.015，0.030，0.060，0.120，0.240，0.480，0.960，1.920，3.840 mmol·L-1)。培养24 h后，每孔加入5 g·L-1的无菌MTT溶液20 μL，继续培养4 h。弃去各孔的培养液，加入150 μL DMSO，200 r·min-1摇床振荡10 min。多功能酶标仪上测定490 nm吸光度(A)，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。细胞存活率 = A实验/ A空白对照× 100%。
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PMBE对HEK293细胞生长的影响：细胞处理方法同1.2项，待细胞生长至融合状态时，加入不同浓度的PMBE(终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1)，培养48 h后，同上用MTT法测定吸光度，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。
PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的保护作用：同1.2项，用不同浓度的PMBE培养24 h，弃去处理液，再加入半抑制浓度(IC50)的顺铂处理24 h。用MTT法测定吸光度，每个剂量设6个复孔，实验重复3次。
1.4 各氧化指标检测 取对数期的细胞以1×105个/mL的浓度接种于6孔板，待细胞生长至融合后，加入不同浓度的PMBE(终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180 mg·L-1)以及Vit C(100 mg·L-1)培养24 h，弃去处理液，再加入半抑制浓度的顺铂处理24 h。, http://www.100md.com(冯冬茹 戴青辰 谢衡 李若达 郑光耀 王金发 王宏斌)