1期调控因子mRNA表达的影响> 独活寄生汤水提物对软骨细胞G1期调控因子mRNA表达的影响(1)
[摘要] 目的：探讨独活寄生汤水提物对软骨细胞G1期的影响。方法：取4周龄雄性SD大鼠，建立软骨细胞体外培养体系，第3代软骨细胞进行干预，采用MTT法检测不同浓度的独活寄生汤水提物对软骨细胞活性的影响；RT-PCR检测空白组、独活寄生汤水提物低、中、高剂量组(100，200，400 mg·L-1)软骨细胞Cyclin D1，CDK4，CDK6及P21 mRNA的表达。结果：MTT法检测显示，在一定的药物质量浓度范围内(50～800 mg·L-1)，软骨细胞活性显著上升(P<0.01)；干预24 h后，Cyclin D1，CDK4及CDK6 mRNA表达量各剂量组明显增加(P<0.05)，200 mg·L-1表达量最大(P<0.01)；P21 mRNA表达量降低，且200 mg·L-1抑制作用最明显(P<0.01)。结论： 独活寄生汤水提物通过影响软骨细胞G1期调控因子mRNA的表达，促进软骨细胞的增殖。
, http://www.100md.com
[关键词] 独活寄生汤；软骨细胞；细胞周期；中药药理
[收稿日期] 2013-04-21
[基金项目] 高等学校博士点专项科研基金项目(20123519110001)；福建省教育厅A类科技杰青项目(JA12165)
[通信作者] 刘献祥，Tel： (0591)22861988，E-mail：liuxianxiang@163.com
骨性关节炎(OA)是一种以软骨退变为核心，软骨下骨囊变为病理特征的常见关节疾病，多发于中老年人。现代研究表明，中药可以通过促进软骨细胞增殖、维持基质的正常表达等环节来恢复关节软骨的代谢平衡，延缓关节软骨退变[1]。独活寄生汤出自唐代著名医药学家孙思邈的《备急千金要方》，由独活、桑寄生、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、杜仲等15味中药组成，具有补肝肾、祛风湿、止痹痛、益气血之功效，被广泛应用于OA的治疗。本实验通过观察不同浓度独活寄生汤水提物对软骨细胞活性的影响，RT-PCR法检测软骨细胞G1期调控因子mRNA的表达，旨在从分子生物学角度探讨独活寄生汤治疗OA的作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠4只，4周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号SCXK(沪)2007-0005。
1.2 药物 独活寄生汤复方(独活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、白芍、熟地黄各6 g)，购自福建中医药大学附属第三人民医院，水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，抽滤，浓缩成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重；称取浸膏100 mg，加入5%FBS培养基10 mL溶解，超声10 min，0.22 μm无菌型微孔滤膜过滤，配成10 g·L-1独活寄生汤水提物干预母液，备用。
1.3 试剂和仪器 胎牛血清(FBS)，DMEM/LOW培养基，PBS缓冲液，胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；MTT，II型胶原酶均购自美国Sigma公司；兔超敏二步法免疫组化检测试剂、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司；TRIZOL试剂(Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(Promega 公司)；PCR引物合成(上海生工生物技术有限公司)；兔抗II型胶原多克隆抗体(美国Bioword公司)。荧光倒置相差显微镜(Olympus公司)；BB16/BB5060型CO2恒温培养箱(德国 Heraus公司)；ATR TECH型无菌操作台(苏净集团安泰公司)；SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰空气技术公司)；ECX-800型酶标仪(美国BIO-Tek公司)；GEL DOC 2000型凝胶成像系统(美国 BIO-RAD公司)；9600型DNA 扩增仪(美国PE生物系统公司)。
, 百拇医药
1.4 软骨细胞的分离培养 4周龄SD大鼠4只，无菌条件下切取关节软骨，剪成 1 mm3的大小，PBS洗涤数次，吸干PBS残液，加入含有0.2%的II型胶原酶的培养皿，放入37 ℃的培养箱中，每隔2 h吸取上清液，1 000 r·min-1离心5 min，弃消化液，收集细胞沉淀，更换消化液，重复4次。用DMEM培养基(含10%小牛血清、链霉素100 mg·L-1和青霉素100 U·mL-1)重悬细胞，接种于50 mL培养瓶中(原代)，待细胞铺满培养瓶底部80%后，进行传代培养(F1代)。
1.5 软骨细胞鉴定 取对数期生长的F3代软骨细胞，按1×105个/mL接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10%FBS DMEM培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，4%多聚甲醛固定30 min；过氧化氢处理10 min；滴加1∶200的兔抗II型胶原多克隆抗体(一抗)，4 ℃孵育过夜；聚合辅助剂处理20 min；山羊抗兔IgG(二抗)，37 ℃孵育30 min；DAB显色10 min，苏木素进行复染(设不加一抗为阴性对照组)。
1.6 软骨细胞活性检测 取对数期生长的F3代细胞进行种板，细胞按5×104个/mL的密度以每孔100 μL加入96孔板，培养24 h后，用不同稀释浓度的独活寄生汤水提物干预细胞，终浓度为50，100，200，400，800 mg·L-1，以5%DMEM培养液作空白对照，另设置调零孔，每个梯度设8个复孔，培养24，48，72 h后，吸尽药液，每孔加入0.1%的MTT溶液100 μL，37 ℃，5%CO2培养箱中继续培养4 h，终止培养，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪490 nm处测定吸光度A，并计算各组细胞活力(以空白组为100%)。, 百拇医药(陈加守 李西海 李会婷 翁霞萍 许惠凤 叶蕻芝 刘献祥)
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[关键词] 独活寄生汤；软骨细胞；细胞周期；中药药理
[收稿日期] 2013-04-21
[基金项目] 高等学校博士点专项科研基金项目(20123519110001)；福建省教育厅A类科技杰青项目(JA12165)
[通信作者] 刘献祥，Tel： (0591)22861988，E-mail：liuxianxiang@163.com
骨性关节炎(OA)是一种以软骨退变为核心，软骨下骨囊变为病理特征的常见关节疾病，多发于中老年人。现代研究表明，中药可以通过促进软骨细胞增殖、维持基质的正常表达等环节来恢复关节软骨的代谢平衡，延缓关节软骨退变[1]。独活寄生汤出自唐代著名医药学家孙思邈的《备急千金要方》，由独活、桑寄生、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、杜仲等15味中药组成，具有补肝肾、祛风湿、止痹痛、益气血之功效，被广泛应用于OA的治疗。本实验通过观察不同浓度独活寄生汤水提物对软骨细胞活性的影响，RT-PCR法检测软骨细胞G1期调控因子mRNA的表达，旨在从分子生物学角度探讨独活寄生汤治疗OA的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠4只，4周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号SCXK(沪)2007-0005。
1.2 药物 独活寄生汤复方(独活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、白芍、熟地黄各6 g)，购自福建中医药大学附属第三人民医院，水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，抽滤，浓缩成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重；称取浸膏100 mg，加入5%FBS培养基10 mL溶解，超声10 min，0.22 μm无菌型微孔滤膜过滤，配成10 g·L-1独活寄生汤水提物干预母液，备用。
1.3 试剂和仪器 胎牛血清(FBS)，DMEM/LOW培养基，PBS缓冲液，胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；MTT，II型胶原酶均购自美国Sigma公司；兔超敏二步法免疫组化检测试剂、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司；TRIZOL试剂(Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(Promega 公司)；PCR引物合成(上海生工生物技术有限公司)；兔抗II型胶原多克隆抗体(美国Bioword公司)。荧光倒置相差显微镜(Olympus公司)；BB16/BB5060型CO2恒温培养箱(德国 Heraus公司)；ATR TECH型无菌操作台(苏净集团安泰公司)；SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰空气技术公司)；ECX-800型酶标仪(美国BIO-Tek公司)；GEL DOC 2000型凝胶成像系统(美国 BIO-RAD公司)；9600型DNA 扩增仪(美国PE生物系统公司)。
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1.4 软骨细胞的分离培养 4周龄SD大鼠4只，无菌条件下切取关节软骨，剪成 1 mm3的大小，PBS洗涤数次，吸干PBS残液，加入含有0.2%的II型胶原酶的培养皿，放入37 ℃的培养箱中，每隔2 h吸取上清液，1 000 r·min-1离心5 min，弃消化液，收集细胞沉淀，更换消化液，重复4次。用DMEM培养基(含10%小牛血清、链霉素100 mg·L-1和青霉素100 U·mL-1)重悬细胞，接种于50 mL培养瓶中(原代)，待细胞铺满培养瓶底部80%后，进行传代培养(F1代)。
1.5 软骨细胞鉴定 取对数期生长的F3代软骨细胞，按1×105个/mL接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10%FBS DMEM培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，4%多聚甲醛固定30 min；过氧化氢处理10 min；滴加1∶200的兔抗II型胶原多克隆抗体(一抗)，4 ℃孵育过夜；聚合辅助剂处理20 min；山羊抗兔IgG(二抗)，37 ℃孵育30 min；DAB显色10 min，苏木素进行复染(设不加一抗为阴性对照组)。
1.6 软骨细胞活性检测 取对数期生长的F3代细胞进行种板，细胞按5×104个/mL的密度以每孔100 μL加入96孔板，培养24 h后，用不同稀释浓度的独活寄生汤水提物干预细胞，终浓度为50，100，200，400，800 mg·L-1，以5%DMEM培养液作空白对照，另设置调零孔，每个梯度设8个复孔，培养24，48，72 h后，吸尽药液，每孔加入0.1%的MTT溶液100 μL，37 ℃，5%CO2培养箱中继续培养4 h，终止培养，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪490 nm处测定吸光度A，并计算各组细胞活力(以空白组为100%)。, 百拇医药(陈加守 李西海 李会婷 翁霞萍 许惠凤 叶蕻芝 刘献祥)