几种因素对悬浮培养人参细胞生长和皂苷积累的影响(1)
[摘要] 为了完善人参细胞悬浮培养体系，论文研究了人参细胞悬浮培养的动态，探明了培养瓶瓶盖透气滤膜的有无，摇床转速和接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响。结果表明人参细胞悬浮培养过程中，细胞生物量和皂苷产量在培养20 d时达到最大值，因此，可将培养期定为20 d。培养瓶盖上有透气滤膜时有利于人参细胞生长和皂苷合成；悬浮培养时摇床转速影响细胞生长但对皂苷合成无影响，转数为120 r·min-1时，皂苷生产量最高。每个培养瓶接种6 g鲜重的细胞时，细胞生长和皂苷积累明显好于其他接种量，总皂苷质量分数达12.8 mg·g-1DW，生产量达146.6 mg·L-1。
[关键词]人参细胞；透气膜；摇床转数；接种量
人参Panax ginseng C. A. Meyer是五加科人参属的多年生药用植物，主要活性成分人参是皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高人体免疫力及延缓衰老等功效[1]。目前，人参栽培以播种作为主要繁殖方式，从播种到收获需要4～6年的时间，管理成本较高，病害严重，且因为防治这些病虫害频繁使用的农药带来的残留问题降低了人参产品质量[2]，同时阻碍其向国外市场出口。因此，利用植物细胞培养工程手段，通过细胞、组织或器官培养获得人参皂苷便成了解决这些问题的有效方法。
, 百拇医药
人参细胞和组织培养兴起于20世纪60年代，其工厂化生产始于20世纪80年代[3]。在进行人参细胞培养过程中，利用液态培养基进行的悬浮培养被认为是一种取代传统固态培养基进行培养的方式，其优势在于细胞增殖速度快，可提供大量均匀一致的培养物[4]。因此，悬浮培养成为植物组织培养走向工业化的必经步骤[5]。由于人参市场的需求量逐年增加，工厂化生产过程中提高人参有效物质的积累越来越受到人们的关注[6]。本试验调查了人参细胞悬浮培养过程中细胞生长和底物消耗的动态，研究了培养瓶的换气条件、摇床转数及接种量对细胞生长和皂苷积累的影响，旨在完善人参细胞悬浮培养技术，为人参皂苷的工厂化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料培养 将在长白山区采集的5年生新鲜人参根部洗净，用洗衣粉稀释液中清洗5 min，然后在流水下冲洗5 h。将洗净的人参根在无菌状态下用70%乙醇浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，最后用无菌水冲洗3～4次。将已消毒的人参根切成1 cm×1 cm的小块接种在MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 6.5 g·L-1的培养基中诱导愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转接到含30 mL培养基(MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+激动素(KT) 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂6.5 g·L-1)的培养皿(9 cm×1.5 cm)中进行继代培养。继代培养3次后，将愈伤组织用刀打碎后接种至含50 mL液态培养基(MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+ KT 0.3 mg·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1)的250 mL的三角瓶中，在转数为100 r·min-1的摇床上培养。培养温度为(25± 2) ℃，相对湿度70%，暗培养。培养20 d后将细胞和培养基的混合液用滤纸过滤后，收集细胞用于实验材料。
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1.2人参细胞生长和皂苷积累及物质消耗动态研究 将悬浮培养的细胞称取4 g鲜重(FW)，接种到含50 mL培养基 (MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+ KT 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1)的250 mL的三角瓶中，在转速为100 r·min-1的摇床上培养。培养温度为(25±2) ℃，相对湿度70%，暗培养。培养过程中，每隔5 d停止培养其中一个培养瓶，用滤纸过滤混合物，收集滤纸上的细胞称鲜重，收集培养基测糖及无机盐浓度。将测完鲜重的细胞放入50 ℃烘干箱中，待完全干燥后(2 d)记录干重，并测定皂苷含量。
1.3培养瓶换气膜的有无对悬浮培养细胞生长和皂苷积累的影响 将4 g人参细胞接种到250 mL的三角瓶中，培养基量为50 mL。培养瓶盖分别用有透气过滤膜(φ= 1 cm)和无透气过滤膜的铝箔纸封盖，每组接种3瓶，20 d后调查细胞鲜重和干重，测定皂苷含量。培养条件与1.2相同。
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1.4摇床转速对细胞生长和皂苷积累的影响 根据1.3的结果，培养瓶用有滤膜的铝箔纸封盖后进行培养，每个培养瓶中细胞的初始接种量为4 g。为了探明摇床转数的影响，将接种的培养瓶分别置于转数为80，100，120 r·min-1的摇床上，20 d后对细胞生物量和皂苷含量进行测定。培养基和培养条件与1.2相同。
1.5接种量对人参细胞生物量及皂苷积累的影响 为探明接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响，在每个培养瓶中分别接种2，4，6，8 g人参细胞，用有滤膜的瓶盖封盖后，将摇床转数调节为120 r·min-1后培养。其他条件同1.3。
1.6皂苷及糖和阴阳离子浓度测定 不定根中人参皂苷测定：按《中国药典》方法[7]，取人参细胞干燥粉末(过100钼筛)1 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷约100 mL，加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移人具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞，放置过夜，超声(250 W，40 kHz)处理30 min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品。待测样品利用配有C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Theromo scientific，美国)的高效液相色谱(LC-15C，岛津公司，日本)，在紫外可见检测器(SPD-15C，岛津公司，日本)203 nm波长处进行检测；进样量为10 μL，流动相为乙腈与水，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃。 人参皂苷对照品Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1由成都曼斯特生物科技有限公司提供。总皂苷含量为单体皂苷之和，皂苷生产量=细胞干重× 20 × 皂苷含量。测定人参皂苷含量的流动相洗脱条件参照Wu等[8]方法，流动相水-乙腈，梯度洗脱程序为0～10 min，75%水；10～15 min，68%水；15～20 min，45%水；20～25 min，40%水25～40 min，0 水；40～50 min，75%水。, http://www.100md.com(李铁军 廉美兰 于丹 邵春绘 朴炫春)
[关键词]人参细胞；透气膜；摇床转数；接种量
人参Panax ginseng C. A. Meyer是五加科人参属的多年生药用植物，主要活性成分人参是皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高人体免疫力及延缓衰老等功效[1]。目前，人参栽培以播种作为主要繁殖方式，从播种到收获需要4～6年的时间，管理成本较高，病害严重，且因为防治这些病虫害频繁使用的农药带来的残留问题降低了人参产品质量[2]，同时阻碍其向国外市场出口。因此，利用植物细胞培养工程手段，通过细胞、组织或器官培养获得人参皂苷便成了解决这些问题的有效方法。
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人参细胞和组织培养兴起于20世纪60年代，其工厂化生产始于20世纪80年代[3]。在进行人参细胞培养过程中，利用液态培养基进行的悬浮培养被认为是一种取代传统固态培养基进行培养的方式，其优势在于细胞增殖速度快，可提供大量均匀一致的培养物[4]。因此，悬浮培养成为植物组织培养走向工业化的必经步骤[5]。由于人参市场的需求量逐年增加，工厂化生产过程中提高人参有效物质的积累越来越受到人们的关注[6]。本试验调查了人参细胞悬浮培养过程中细胞生长和底物消耗的动态，研究了培养瓶的换气条件、摇床转数及接种量对细胞生长和皂苷积累的影响，旨在完善人参细胞悬浮培养技术，为人参皂苷的工厂化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料培养 将在长白山区采集的5年生新鲜人参根部洗净，用洗衣粉稀释液中清洗5 min，然后在流水下冲洗5 h。将洗净的人参根在无菌状态下用70%乙醇浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，最后用无菌水冲洗3～4次。将已消毒的人参根切成1 cm×1 cm的小块接种在MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 6.5 g·L-1的培养基中诱导愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转接到含30 mL培养基(MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+激动素(KT) 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1 +琼脂6.5 g·L-1)的培养皿(9 cm×1.5 cm)中进行继代培养。继代培养3次后，将愈伤组织用刀打碎后接种至含50 mL液态培养基(MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+ KT 0.3 mg·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1)的250 mL的三角瓶中，在转数为100 r·min-1的摇床上培养。培养温度为(25± 2) ℃，相对湿度70%，暗培养。培养20 d后将细胞和培养基的混合液用滤纸过滤后，收集细胞用于实验材料。
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1.2人参细胞生长和皂苷积累及物质消耗动态研究 将悬浮培养的细胞称取4 g鲜重(FW)，接种到含50 mL培养基 (MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+ KT 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1)的250 mL的三角瓶中，在转速为100 r·min-1的摇床上培养。培养温度为(25±2) ℃，相对湿度70%，暗培养。培养过程中，每隔5 d停止培养其中一个培养瓶，用滤纸过滤混合物，收集滤纸上的细胞称鲜重，收集培养基测糖及无机盐浓度。将测完鲜重的细胞放入50 ℃烘干箱中，待完全干燥后(2 d)记录干重，并测定皂苷含量。
1.3培养瓶换气膜的有无对悬浮培养细胞生长和皂苷积累的影响 将4 g人参细胞接种到250 mL的三角瓶中，培养基量为50 mL。培养瓶盖分别用有透气过滤膜(φ= 1 cm)和无透气过滤膜的铝箔纸封盖，每组接种3瓶，20 d后调查细胞鲜重和干重，测定皂苷含量。培养条件与1.2相同。
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1.4摇床转速对细胞生长和皂苷积累的影响 根据1.3的结果，培养瓶用有滤膜的铝箔纸封盖后进行培养，每个培养瓶中细胞的初始接种量为4 g。为了探明摇床转数的影响，将接种的培养瓶分别置于转数为80，100，120 r·min-1的摇床上，20 d后对细胞生物量和皂苷含量进行测定。培养基和培养条件与1.2相同。
1.5接种量对人参细胞生物量及皂苷积累的影响 为探明接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响，在每个培养瓶中分别接种2，4，6，8 g人参细胞，用有滤膜的瓶盖封盖后，将摇床转数调节为120 r·min-1后培养。其他条件同1.3。
1.6皂苷及糖和阴阳离子浓度测定 不定根中人参皂苷测定：按《中国药典》方法[7]，取人参细胞干燥粉末(过100钼筛)1 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷约100 mL，加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移人具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞，放置过夜，超声(250 W，40 kHz)处理30 min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品。待测样品利用配有C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Theromo scientific，美国)的高效液相色谱(LC-15C，岛津公司，日本)，在紫外可见检测器(SPD-15C，岛津公司，日本)203 nm波长处进行检测；进样量为10 μL，流动相为乙腈与水，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃。 人参皂苷对照品Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1由成都曼斯特生物科技有限公司提供。总皂苷含量为单体皂苷之和，皂苷生产量=细胞干重× 20 × 皂苷含量。测定人参皂苷含量的流动相洗脱条件参照Wu等[8]方法，流动相水-乙腈，梯度洗脱程序为0～10 min，75%水；10～15 min，68%水；15～20 min，45%水；20～25 min，40%水25～40 min，0 水；40～50 min，75%水。, http://www.100md.com(李铁军 廉美兰 于丹 邵春绘 朴炫春)