雷公藤甲素通过抗ER磷酸化抑制小鼠4T1乳腺癌增殖作用研究(2)
2.2FITC-Annexin V/PI法检测细胞凋亡率 取对数生长期细胞,制备浓度为1×106个/mL细胞悬液接种于60 mm培养皿中,置37 ℃,5% CO2培养箱培养24 h后,弃掉培养液,加入不同浓度的TP,使其终浓度为10,1,0.1 μmol·L-1,同时设对照组,继续培养24 h后,0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞置离心管,1 000 r·min-1离心5 min,冷PBS清洗。1×Binding Buffer重悬细胞至1×106个/mL,加入FITC-Annexin V避光孵育15 min,加10 μL PI(250 mg·L-1)溶液染色15 min后上机检测。2.3Western blotting法检测相关蛋白表达 取对数生长期细胞,不同浓度TP处理2 h后,0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞,冷PBS清洗后加裂解液300 μL(含1%蛋白酶磷酸酶抑制剂混合液),4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min ......
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