寒凉药对热证大鼠肝线粒体蛋白质组的影响(1)
[摘要] 自20世纪60年代起，现代科学开始对热证的本质进行研究，但有关热证的病理机制和寒凉药物的作用机制等尚未深入系统研究。该研究以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型，后用寒凉药进行实验性治疗，拟采用双向电泳及质谱分析技术对热证模型大鼠及寒凉药治疗后的大鼠肝线粒体蛋白组进行比较，从中发现热证及寒凉药治疗后的特异性相关蛋白质。
[关键词]寒凉药；热证；线粒体；蛋白质组
寒热是用以概括机体阴阳盛衰的两类证候。祖国医学认为“阳胜则外热”、“阴虚则内热”，在临床上热证主要表现为：恶热喜冷，烦躁不安，口眼干燥，面红目赤，咳痰黄稠，舌红脉数等，综合起来以基础代谢率偏高，机体能量过剩为特征。热证的形成机理有很多，中医古籍《黄帝内经》等对其病因均有介绍，自20世纪60年代起，现代科学开始对热证的本质进行研究，然而目前有关热证的病理机制和寒凉药物的作用机制等，尚未深入系统研究[1]。
, 百拇医药
肝脏是人体重要的代谢器官，肝细胞中的线粒体则是重要的细胞器，是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，在能量代谢中发挥着重要的作用。本研究以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型，后用寒凉药进行实验性治疗，拟采用双向电泳及质谱分析技术对热证模型大鼠及寒凉药治疗后的大鼠肝线粒体蛋白组进行比较，从中发现热证及寒凉药治疗后的特异性相关蛋白质，在线粒体蛋白质组水平阐述中医热证能量代谢障碍的内在物质基础及寒凉药的作用机制，进而指导中医的临床诊断与治疗。
1材料与方法
1.1药材与试剂 所有中药均采购于杭州方回春堂药店。温热药以附子、干姜、肉桂按1∶1∶1比例，常规煎2次，合并浓缩至1 g·mL-1；寒凉药以黄芩、黄连、黄柏按1∶1∶1比例，常规煎2次，合并浓缩至1 g·mL-1。双向电泳相关试剂均购自Bio-Rad公司，酶解试剂均购自Sigma公司。
1.2动物分组及造模 清洁级SD雄性大鼠18只，体重180～220 g，购自浙江大学动物实验中心，随机分为正常对照组、热证模型组和药物治疗组。参照徐志伟等[2]的实验方法，正常对照组动物正常饮食，每鼠每日灌喂生理盐水4 mL，共4周；热证模型组每鼠每日灌以温热药4 mL(约含4 g生药)，造模2周后继续每鼠每日4 mL生理盐水灌胃2周；药物治疗组为造模2周后每鼠每日继续灌以寒凉药4 mL(约含4 g生药)2周。
, 百拇医药
1.3常规生理指标检测 4周后开始分别测定3组大鼠体重增长值，24 h尿量，饮水量和饮食量，并测定肛温。
1.4血清激素含量测定 4周后采用眼眶后静脉丛取血法。每组每只大鼠采血3～4 mL，分离出血清，运用双抗体夹心化学发光两步法检测血清T3，T4含量；应用固相竞争化学发光酶免疫分析法测定睾酮含量。
1.5大鼠线粒体蛋白质提取及差异蛋白质分析 4周后处死大鼠，取肝脏匀浆，按文献方法提取肝脏线粒体蛋白质[3-4]，进行双向电泳，每组重复3次。经UMAX ImageScanner凝胶扫描仪扫描图谱，运用ImageMaster软件分别进行两两比较。分别取2组间相互匹配且具有明显表达差异(Variation>2.0，P<0.05)的蛋白质进行酶解及质谱鉴定。
2结果
2.1常规生理指标观察 热证大鼠体消瘦，烦躁、多动，口渴喜饮，厌食，皮毛干燥无光泽，竖毛易掉落，灌药时挣扎较明显，尿液少且颜色明显红赤，大便干硬。经寒凉药治疗后大鼠各项症状、体征均有明显改善，见表1。
, 百拇医药
与对照组大鼠比较，模型组大鼠饮食及体重显著下降，饮水量显著增加，尿量及肛温无明显改变，使用寒凉药治疗后大鼠饮食及体重显著增加，饮水量显著下降，其余指标未明显改变。
2.2激素水平变化 甲状腺激素在体内的主要作用是促进组织氧化及产热，使机体能量代谢维持一定水平，从而稳定体温[5]。中医认为：阳盛则热，与对照组比较，模型组大鼠血清T3，T4明显升高；在经过寒凉药治疗后血清T3，T4显著降低。睾酮可使血循环增加，增加促血红素生成，提高血红蛋白含量，符合热证特征，为构成热证的因素之一[6]。与对照组比较，模型组大鼠血清睾酮含量显著升高，而寒凉药治疗后显著降低，见表2。
2.3大鼠肝脏线粒体蛋白质组学分析 经图谱分析，见图1，对照组3块凝胶的平均蛋白质点为962个，模型组3块凝胶的平均蛋白质点为816个，寒药治疗组6块凝胶的平均蛋白质点为993个。分别进行两两比较，与对照组相比，热证模型组有12个蛋白质表达显著改变，见表3；与模型组相比，寒药治疗组有17个蛋白质表达显著改变，见表4。
, http://www.100md.com
3分析与讨论
3.1热证治疗前后糖、脂肪、蛋白质代谢的变化 热证大鼠中与糖和蛋白质代谢降低，主要表现为与糖代谢有关的乙醛脱氢酶和与蛋白质代谢有关的异戊酰辅酶A脱氢酶(反映人体内亮氨酸代谢情况)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(反映人体内胱氨酸代谢情况)表达降低，该抑制可能由于内热引起的糖和蛋白质代谢过盛引起的反馈抑制。
寒凉药不影响热证大鼠的糖和蛋白质代谢，但大鼠脂代谢增强，表现在与糖代谢相关的二氢硫辛酰胺酰基转移酶(是丙酮酸脱氢酶系和α-酮戊二酸脱氢酶系中的一个关键酶)和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶降低，此外，与蛋白质代谢相关的氨甲酰磷酸合成酶和核糖体蛋白L12降低，而与脂肪代谢相关的3-羟基异丁酸脱氢酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、烯酰辅酶A水解酶，线粒体内膜移位酶表达均升高。说明寒凉药能抑制糖和蛋白质的过度消耗，却能增加脂肪的代谢，通过这种调节方式使机体从热证状态下恢复过来，以维持正常的人体生理功能。
3.2热证治疗前后能量代谢的变化 能量代谢非常复杂并涉及到氧化磷酸化过程中的许多酶和因子，而这些酶和因子起着网络调控作用，目前对它代谢中的复杂代谢途径及通路了解尚少[7-8]。在经过寒凉药治疗后，电子传递黄素蛋白和ATP合酶β亚单位表达升高，电子传递黄素蛋白是呼吸链的组成成分[9]，ATP合酶β亚单位存在于线粒体内膜[10]，是ATP合酶的催化亚基，二者的表达升高说明寒凉药物能够恢复细胞内的能量代谢，减少应激反应。, 百拇医药(李毅 卢德赵 唐利华 沃兴德 杨贞)
[关键词]寒凉药；热证；线粒体；蛋白质组
寒热是用以概括机体阴阳盛衰的两类证候。祖国医学认为“阳胜则外热”、“阴虚则内热”，在临床上热证主要表现为：恶热喜冷，烦躁不安，口眼干燥，面红目赤，咳痰黄稠，舌红脉数等，综合起来以基础代谢率偏高，机体能量过剩为特征。热证的形成机理有很多，中医古籍《黄帝内经》等对其病因均有介绍，自20世纪60年代起，现代科学开始对热证的本质进行研究，然而目前有关热证的病理机制和寒凉药物的作用机制等，尚未深入系统研究[1]。
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肝脏是人体重要的代谢器官，肝细胞中的线粒体则是重要的细胞器，是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，在能量代谢中发挥着重要的作用。本研究以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型，后用寒凉药进行实验性治疗，拟采用双向电泳及质谱分析技术对热证模型大鼠及寒凉药治疗后的大鼠肝线粒体蛋白组进行比较，从中发现热证及寒凉药治疗后的特异性相关蛋白质，在线粒体蛋白质组水平阐述中医热证能量代谢障碍的内在物质基础及寒凉药的作用机制，进而指导中医的临床诊断与治疗。
1材料与方法
1.1药材与试剂 所有中药均采购于杭州方回春堂药店。温热药以附子、干姜、肉桂按1∶1∶1比例，常规煎2次，合并浓缩至1 g·mL-1；寒凉药以黄芩、黄连、黄柏按1∶1∶1比例，常规煎2次，合并浓缩至1 g·mL-1。双向电泳相关试剂均购自Bio-Rad公司，酶解试剂均购自Sigma公司。
1.2动物分组及造模 清洁级SD雄性大鼠18只，体重180～220 g，购自浙江大学动物实验中心，随机分为正常对照组、热证模型组和药物治疗组。参照徐志伟等[2]的实验方法，正常对照组动物正常饮食，每鼠每日灌喂生理盐水4 mL，共4周；热证模型组每鼠每日灌以温热药4 mL(约含4 g生药)，造模2周后继续每鼠每日4 mL生理盐水灌胃2周；药物治疗组为造模2周后每鼠每日继续灌以寒凉药4 mL(约含4 g生药)2周。
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1.3常规生理指标检测 4周后开始分别测定3组大鼠体重增长值，24 h尿量，饮水量和饮食量，并测定肛温。
1.4血清激素含量测定 4周后采用眼眶后静脉丛取血法。每组每只大鼠采血3～4 mL，分离出血清，运用双抗体夹心化学发光两步法检测血清T3，T4含量；应用固相竞争化学发光酶免疫分析法测定睾酮含量。
1.5大鼠线粒体蛋白质提取及差异蛋白质分析 4周后处死大鼠，取肝脏匀浆，按文献方法提取肝脏线粒体蛋白质[3-4]，进行双向电泳，每组重复3次。经UMAX ImageScanner凝胶扫描仪扫描图谱，运用ImageMaster软件分别进行两两比较。分别取2组间相互匹配且具有明显表达差异(Variation>2.0，P<0.05)的蛋白质进行酶解及质谱鉴定。
2结果
2.1常规生理指标观察 热证大鼠体消瘦，烦躁、多动，口渴喜饮，厌食，皮毛干燥无光泽，竖毛易掉落，灌药时挣扎较明显，尿液少且颜色明显红赤，大便干硬。经寒凉药治疗后大鼠各项症状、体征均有明显改善，见表1。
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与对照组大鼠比较，模型组大鼠饮食及体重显著下降，饮水量显著增加，尿量及肛温无明显改变，使用寒凉药治疗后大鼠饮食及体重显著增加，饮水量显著下降，其余指标未明显改变。
2.2激素水平变化 甲状腺激素在体内的主要作用是促进组织氧化及产热，使机体能量代谢维持一定水平，从而稳定体温[5]。中医认为：阳盛则热，与对照组比较，模型组大鼠血清T3，T4明显升高；在经过寒凉药治疗后血清T3，T4显著降低。睾酮可使血循环增加，增加促血红素生成，提高血红蛋白含量，符合热证特征，为构成热证的因素之一[6]。与对照组比较，模型组大鼠血清睾酮含量显著升高，而寒凉药治疗后显著降低，见表2。
2.3大鼠肝脏线粒体蛋白质组学分析 经图谱分析，见图1，对照组3块凝胶的平均蛋白质点为962个，模型组3块凝胶的平均蛋白质点为816个，寒药治疗组6块凝胶的平均蛋白质点为993个。分别进行两两比较，与对照组相比，热证模型组有12个蛋白质表达显著改变，见表3；与模型组相比，寒药治疗组有17个蛋白质表达显著改变，见表4。
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3分析与讨论
3.1热证治疗前后糖、脂肪、蛋白质代谢的变化 热证大鼠中与糖和蛋白质代谢降低，主要表现为与糖代谢有关的乙醛脱氢酶和与蛋白质代谢有关的异戊酰辅酶A脱氢酶(反映人体内亮氨酸代谢情况)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(反映人体内胱氨酸代谢情况)表达降低，该抑制可能由于内热引起的糖和蛋白质代谢过盛引起的反馈抑制。
寒凉药不影响热证大鼠的糖和蛋白质代谢，但大鼠脂代谢增强，表现在与糖代谢相关的二氢硫辛酰胺酰基转移酶(是丙酮酸脱氢酶系和α-酮戊二酸脱氢酶系中的一个关键酶)和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶降低，此外，与蛋白质代谢相关的氨甲酰磷酸合成酶和核糖体蛋白L12降低，而与脂肪代谢相关的3-羟基异丁酸脱氢酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、烯酰辅酶A水解酶，线粒体内膜移位酶表达均升高。说明寒凉药能抑制糖和蛋白质的过度消耗，却能增加脂肪的代谢，通过这种调节方式使机体从热证状态下恢复过来，以维持正常的人体生理功能。
3.2热证治疗前后能量代谢的变化 能量代谢非常复杂并涉及到氧化磷酸化过程中的许多酶和因子，而这些酶和因子起着网络调控作用，目前对它代谢中的复杂代谢途径及通路了解尚少[7-8]。在经过寒凉药治疗后，电子传递黄素蛋白和ATP合酶β亚单位表达升高，电子传递黄素蛋白是呼吸链的组成成分[9]，ATP合酶β亚单位存在于线粒体内膜[10]，是ATP合酶的催化亚基，二者的表达升高说明寒凉药物能够恢复细胞内的能量代谢，减少应激反应。, 百拇医药(李毅 卢德赵 唐利华 沃兴德 杨贞)