双相体系中固定化酶水解黄芩苷制备黄芩素的研究(1)
[摘要] 该文研究了双相体系中固定β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷制备黄芩素的最佳工艺条件并考察其产率，考察了黄芩素在多种有机溶剂中的溶解性及其在水与有机溶剂中的分配系数，确定了固定化酶催化黄芩苷酶解反应在醋酸缓冲液和氯仿组成双相体系中进行。以海藻酸钠为载体，用交联-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶，并测定了其最适反应温度，最适反应pH，米氏常数，热稳定性和pH稳定性等酶学性质。比较了固定化酶在双相体系中水解黄芩苷的产率，得出最佳反应条件：pH 5.0的醋酸缓冲液和三氯甲烷组成的双相体系，反应温度50 ℃，反应时间10 h，黄芩素产率为85.28%。与单相反应体系相比，双相反应体系中反应速度和产率均有所提高。
[关键词] 固定化β-葡萄糖苷酶；黄芩苷；黄芩素；双相体系；生物催化
黄芩素即黄芩苷元，是一种黄酮类化合物，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的主要活性成分之一，其具有降低脑血管阻力、改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，临床用于脑血管病后瘫痪的治疗[1]。黄芩苷的体内代谢动力学研究表明，口服黄芩苷一般需经胃肠道菌丛酶解或肝微粒体转化成黄芩素后，被人体空肠段快速吸收，故黄芩苷功效的发挥受生物因素影响很大，如胃肠道功能、菌丛种类和数量、生理病理状态等。因此直接由黄芩素开发的制剂应可避免上述问题[2]。
, 百拇医药
传统提取方法一般直接从药材中提取黄芩素，但其在黄芩中含量低，其质量分数只有0.04%～0.28%，因此提取成本较高。此外，黄芩素结构中含有3个邻位酚羟基，水中微量的金属离子、氧气可促进黄芩素氧化为醌类衍生物而显绿色，生成副产品[3]。提取的难度限制了黄芩素的生产和应用。近期很多研究开始使用酶解法制备黄芩素，在很大程度上提高了黄芩素的来源[4-5]。酶水解法具有反应条件温和、副产品少、产物品质高等优点，但酶解率相对不高，酶无法回收利用，生产成本高，且酶容易失活，不易储存。
近年来，双相体系酶解反应以反应速率快、产率高、副产物少等特点而被关注，但是由于酶在有机溶剂中易失活，所以常以固定化酶的形式进行反应[6-9]。本文对固定化酶转化黄芩苷进行了研究，采用了水和三氯甲烷组成的两相体系进行酶催化反应，以达到提高反应速率和产率的目的。
1 材料
, 百拇医药
85-2型恒温磁力搅拌器(上海青浦沪西仪器厂)；HHS-2型电热恒温调节器(上海沪南科学仪器联营厂)；WFZ-UV-2000型紫外-可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；RE52-2型旋转蒸发器(上海沪西仪器厂)；Agilent 1100高效液相色谱仪(G1314A型VWD检测器，Agilent ChemStation色谱工作站)。
海藻酸钠(CP， 国药集团化学试剂有限公司)；戊二醛(25%水溶液，BR， 上海凌峰化学试剂有限公司)；黄芩苷(纯度为70%， 实验室自制)；β-葡萄糖苷酶(上海宝丰生化有限公司)。黄芩苷、黄芩素对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为 110715-200815，111595-200905)；其余试剂为分析纯。
2 方法
2.1 DNS法测定β-葡萄糖苷酶活力
取β-葡萄糖苷酶溶液0.1 mL，加入0.5%的黄芩苷溶液1.9 mL(用0.2 mol·L-1 pH 5.0的醋酸钠缓冲液配制)，50 ℃水浴反应30 min后，立即加入1 mol·L-1碳酸钠溶液2 mL终止反应，然后用DNS法测定生成的葡萄糖含量[10-11]。
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酶活力定义为在50 ℃，pH 4.5条件下，1 mg酶(或1 g固定化酶)每1 min水解黄芩苷反应生成1 mg葡萄糖醛酸的酶活力为一个酶活力单位(U)。
2.2 黄芩苷和黄芩素分配系数的测定
精密配制0.1 g·L-1的黄芩苷对照品母液，分别取黄芩苷对照品母液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，配制成10 mL溶液；分别测定吸光度，以黄芩苷溶液质量浓度Y(g·L-1)对吸光度(X)进行回归分析。
取pH 4.5的缓冲液10 mL与有机溶剂10 mL混合后，加入黄芩苷5 mg，充分混合，50 ℃振荡1 h，室温静置分层后，分别取上层和下层溶液0.1 mL于1.5 mL离心管中，水浴加热挥干溶剂后，定容至10 mL，测定其吸光度，并计算分配系数P。P=有机相中黄芩苷的质量浓度/水相中黄芩苷的质量浓度。黄芩素分配系数的测定方法与黄芩苷相同。
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2.3 β-葡萄糖苷酶的固定化[8]
称取海藻酸钠0.6 g加去离子水20 mL，加热溶解。按比例加入一定浓度的游离β-葡萄糖苷酶酶液5 mL，充分混合。然后加入25%戊二醛溶液0.64 mL，室温搅拌交联2 h。用注射器吸取上述溶液，以10 cm左右的高度逐滴滴入100 mL一定浓度的氯化钙溶液中，形成直径约为3 mm的光滑凝胶小球，静置硬化2 h。滤出凝胶颗粒，用去离子水洗涤，吸干表面水分，贮存于4 ℃冰箱中。固定化酶活力回收率=固定化酶总活力/加入的游离酶总活力×100%。
2.4 β-葡萄糖苷酶的酶学性质的测定
2.4.1 最适反应pH 分别用pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的醋酸缓冲液测定β-葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的pH为最适反应pH。
2.4.2 最适反应温度 分别在40，45，50，55，60，65 ℃温度下测定β-葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的温度为最适反应温度。, http://www.100md.com(杨轶舜 程涛 杨骏 张彤 蔡贞贞)
[关键词] 固定化β-葡萄糖苷酶；黄芩苷；黄芩素；双相体系；生物催化
黄芩素即黄芩苷元，是一种黄酮类化合物，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的主要活性成分之一，其具有降低脑血管阻力、改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，临床用于脑血管病后瘫痪的治疗[1]。黄芩苷的体内代谢动力学研究表明，口服黄芩苷一般需经胃肠道菌丛酶解或肝微粒体转化成黄芩素后，被人体空肠段快速吸收，故黄芩苷功效的发挥受生物因素影响很大，如胃肠道功能、菌丛种类和数量、生理病理状态等。因此直接由黄芩素开发的制剂应可避免上述问题[2]。
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传统提取方法一般直接从药材中提取黄芩素，但其在黄芩中含量低，其质量分数只有0.04%～0.28%，因此提取成本较高。此外，黄芩素结构中含有3个邻位酚羟基，水中微量的金属离子、氧气可促进黄芩素氧化为醌类衍生物而显绿色，生成副产品[3]。提取的难度限制了黄芩素的生产和应用。近期很多研究开始使用酶解法制备黄芩素，在很大程度上提高了黄芩素的来源[4-5]。酶水解法具有反应条件温和、副产品少、产物品质高等优点，但酶解率相对不高，酶无法回收利用，生产成本高，且酶容易失活，不易储存。
近年来，双相体系酶解反应以反应速率快、产率高、副产物少等特点而被关注，但是由于酶在有机溶剂中易失活，所以常以固定化酶的形式进行反应[6-9]。本文对固定化酶转化黄芩苷进行了研究，采用了水和三氯甲烷组成的两相体系进行酶催化反应，以达到提高反应速率和产率的目的。
1 材料
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85-2型恒温磁力搅拌器(上海青浦沪西仪器厂)；HHS-2型电热恒温调节器(上海沪南科学仪器联营厂)；WFZ-UV-2000型紫外-可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；RE52-2型旋转蒸发器(上海沪西仪器厂)；Agilent 1100高效液相色谱仪(G1314A型VWD检测器，Agilent ChemStation色谱工作站)。
海藻酸钠(CP， 国药集团化学试剂有限公司)；戊二醛(25%水溶液，BR， 上海凌峰化学试剂有限公司)；黄芩苷(纯度为70%， 实验室自制)；β-葡萄糖苷酶(上海宝丰生化有限公司)。黄芩苷、黄芩素对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为 110715-200815，111595-200905)；其余试剂为分析纯。
2 方法
2.1 DNS法测定β-葡萄糖苷酶活力
取β-葡萄糖苷酶溶液0.1 mL，加入0.5%的黄芩苷溶液1.9 mL(用0.2 mol·L-1 pH 5.0的醋酸钠缓冲液配制)，50 ℃水浴反应30 min后，立即加入1 mol·L-1碳酸钠溶液2 mL终止反应，然后用DNS法测定生成的葡萄糖含量[10-11]。
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酶活力定义为在50 ℃，pH 4.5条件下，1 mg酶(或1 g固定化酶)每1 min水解黄芩苷反应生成1 mg葡萄糖醛酸的酶活力为一个酶活力单位(U)。
2.2 黄芩苷和黄芩素分配系数的测定
精密配制0.1 g·L-1的黄芩苷对照品母液，分别取黄芩苷对照品母液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，配制成10 mL溶液；分别测定吸光度，以黄芩苷溶液质量浓度Y(g·L-1)对吸光度(X)进行回归分析。
取pH 4.5的缓冲液10 mL与有机溶剂10 mL混合后，加入黄芩苷5 mg，充分混合，50 ℃振荡1 h，室温静置分层后，分别取上层和下层溶液0.1 mL于1.5 mL离心管中，水浴加热挥干溶剂后，定容至10 mL，测定其吸光度，并计算分配系数P。P=有机相中黄芩苷的质量浓度/水相中黄芩苷的质量浓度。黄芩素分配系数的测定方法与黄芩苷相同。
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2.3 β-葡萄糖苷酶的固定化[8]
称取海藻酸钠0.6 g加去离子水20 mL，加热溶解。按比例加入一定浓度的游离β-葡萄糖苷酶酶液5 mL，充分混合。然后加入25%戊二醛溶液0.64 mL，室温搅拌交联2 h。用注射器吸取上述溶液，以10 cm左右的高度逐滴滴入100 mL一定浓度的氯化钙溶液中，形成直径约为3 mm的光滑凝胶小球，静置硬化2 h。滤出凝胶颗粒，用去离子水洗涤，吸干表面水分，贮存于4 ℃冰箱中。固定化酶活力回收率=固定化酶总活力/加入的游离酶总活力×100%。
2.4 β-葡萄糖苷酶的酶学性质的测定
2.4.1 最适反应pH 分别用pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的醋酸缓冲液测定β-葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的pH为最适反应pH。
2.4.2 最适反应温度 分别在40，45，50，55，60，65 ℃温度下测定β-葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的温度为最适反应温度。, http://www.100md.com(杨轶舜 程涛 杨骏 张彤 蔡贞贞)