催眠睡茄Withania somnifera 毛状根的诱导及睡茄素A的合成(1)
[摘要] 睡茄素A是存在于催眠睡茄的根和叶中的主要次生代谢产物之一。该实验以催眠睡茄的无菌苗叶片为外植体，利用发根农杆菌C58C1诱导催眠睡茄毛状根，诱导率达30%。同时，利用HPLC测定野生催眠睡茄植株的根、茎、叶和30 d液体悬浮培养的毛状根中睡茄素A的含量结果表明，毛状根中睡茄素A平均质量分数为1.588 mg·g-1，是野生植株平均含量的1.96倍；其中，毛状根系M3的睡茄素A含量最高，质量分数达到1.783 mg·g-1，是野生型催眠睡茄植株根含量的1.51倍。因此，可以培养催眠睡茄毛状根来获得睡茄素A。
[关键词] 催眠睡茄；毛状根；睡茄素A；HPLC
[收稿日期] 2013-07-16
[基金项目] 中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK20120088)；贵州省功能材料与资源化学特色重点实验室开放基金项目
, 百拇医药
[通信作者] *孙敏，Tel：(023)68254061，E-mail： jwcsm@swu.edu.cn
[作者简介] 王凤英，硕士研究生，E-mail：misswangfengying@163.com
催眠睡茄Withania somnifera L为茄科Solanaceae睡茄属Withania植物，又名印度人参，主要生长在印度、巴基斯坦、埃及、刚果、南非等地。催眠睡茄植株中含有睡茄素类、醉茄素类等各种生物碱[1]，具有抗炎、抗压、抗氧化、抗肿瘤等功效，常被用于治疗哮喘、老年痴呆、焦虑、帕金森综合症及认知神经紊乱等[2]。在印度，催眠睡茄还常被用于壮阳、镇静、延长寿命等。睡茄素A是睡茄属植物的主要有效成分，研究表明，其有较强的抗癌活性[3-4]，能够促进神经突起的分支和突触的重建，被广泛应用于治疗老年痴呆、帕金森症等各种神经性疾病[5]。
随着对催眠睡茄活性成分的药理学研究和分析，其药理作用清晰明确，加快了催眠睡茄在保健及医药中的开发和应用，其需求也日益增长。通过现代生物技术手段来提高次生代谢产物的生物合成量势在必行，国内外通过组织培养技术[6-10]来扩大催眠睡茄的种质资源，以提高其次生代谢产物含量。毛状根的形成是发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA片段在植物核基因组中整合及表达的结果，其培养系统在生物量的增加，药用有效成分的积累以及生产稳定性方面都具有其独特的优越性，使得利用毛状根培养生产植物次生代谢产物具有极大的生产潜力[11]。原植物中睡茄素A的含量较低[12]无法满足不断增加的市场需求。国外有将催眠毛状根进行培养条件优化[13]及将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入到催眠睡茄毛状根中以提高睡茄素A的含量[14]来解决睡茄素A的资源短缺问题的相关报道，但效果不显著。因此，本实验利用发根农杆菌C58C1诱导催眠睡茄叶片产生毛状根，同时优化睡茄素A的提取方法，为建立和筛选高效合成睡茄素A的优良毛状根体系奠定基础。
, 百拇医药
1 材料
催眠睡茄种子由西南大学梁国鲁教授惠赠。以培养20 d的无菌催眠睡茄幼苗的叶片为外植体。
发根农杆菌C58C1(C58C1 是根癌农杆菌经“Disarmed”改造后，保留Helper 质粒，导入pRiA4 质粒而成的发根农杆菌)由西南大学廖志华教授提供。
岛津 LC-20AD自动进样高效液相色谱仪；睡茄素A对照品购于Nature Remedies Private Limited，(HPLC≥95%)。
2 方法
2.1 C58C1菌株的活化
取发根农杆菌C58C1菌种，于YEB附加40 mg·L-1利福平(Rif)的固体培养基划线培养，挑取单菌落，接种于10 mL附加40 mg·L-1利福平(Rif)的YEB液体培养基中，200 r·min-1，27 ℃振荡培养24 h为第1次活化菌液，取100 μL第1次活化菌液接种于50 mL的YEB附加40 mg·L-1 Rif的液体培养基中，200 r·min-1，27 ℃振荡培养至A600 0.3左右(约12 h)，加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为100 μmol·L-1，继续活化3 h。将50 mL活化好的菌液移入无菌离心管中，4 000 r·min-1，离心10 min，用50 mL附加有100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基重悬菌体，继续于200 r·min-1，27 ℃振荡培养30 min，获得的菌体用于转化催眠睡茄外植体[15]。
, http://www.100md.com
2.2 催眠睡茄毛状根的获得
将处理好的催眠睡茄叶片浸入C58C1的悬浮液中，200 r·min-1，27 ℃振荡20 min后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，接种于附加100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的MS固体培养基中，27 ℃黑暗共培养4～5 d至叶片周围有菌圈出现时，取出叶片，无菌水200 r·min-1振荡洗涤3次，每次10 min，无菌吸水纸吸干水分后接种于附加300 mg·L-1的头孢噻肟钠(Cef)的MS固体培养基中光照培养，每4 d更换1次培养基，直至毛状根长出。
2.3 毛状根的液体培养
当毛状根生长至3 cm左右时，剪下分别接种于含300 mg·L-1的头孢噻肟钠(Cef)的1/2 MS培养基中，每7 d剪取毛状根的根尖继代培养，继代5～6次后，将毛状根转移至YEB琼脂培养基上培养7 d，检测毛状根无农杆菌污染后，接种于1/2 MS液体培养基中，110 r·min-1，27 ℃振荡培养。每20 d左右更换一次培养基，培养30 d左右收获毛状根用于分子检测后，选择性状保持稳定且生长迅速的阳性毛状根克隆进行扩大培养，30 d左右测定睡茄素A的含量。, 百拇医药(王凤英 孙一铭 吕翠萍 程孟琪 张来 孙敏)
[关键词] 催眠睡茄；毛状根；睡茄素A；HPLC
[收稿日期] 2013-07-16
[基金项目] 中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK20120088)；贵州省功能材料与资源化学特色重点实验室开放基金项目
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[通信作者] *孙敏，Tel：(023)68254061，E-mail： jwcsm@swu.edu.cn
[作者简介] 王凤英，硕士研究生，E-mail：misswangfengying@163.com
催眠睡茄Withania somnifera L为茄科Solanaceae睡茄属Withania植物，又名印度人参，主要生长在印度、巴基斯坦、埃及、刚果、南非等地。催眠睡茄植株中含有睡茄素类、醉茄素类等各种生物碱[1]，具有抗炎、抗压、抗氧化、抗肿瘤等功效，常被用于治疗哮喘、老年痴呆、焦虑、帕金森综合症及认知神经紊乱等[2]。在印度，催眠睡茄还常被用于壮阳、镇静、延长寿命等。睡茄素A是睡茄属植物的主要有效成分，研究表明，其有较强的抗癌活性[3-4]，能够促进神经突起的分支和突触的重建，被广泛应用于治疗老年痴呆、帕金森症等各种神经性疾病[5]。
随着对催眠睡茄活性成分的药理学研究和分析，其药理作用清晰明确，加快了催眠睡茄在保健及医药中的开发和应用，其需求也日益增长。通过现代生物技术手段来提高次生代谢产物的生物合成量势在必行，国内外通过组织培养技术[6-10]来扩大催眠睡茄的种质资源，以提高其次生代谢产物含量。毛状根的形成是发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA片段在植物核基因组中整合及表达的结果，其培养系统在生物量的增加，药用有效成分的积累以及生产稳定性方面都具有其独特的优越性，使得利用毛状根培养生产植物次生代谢产物具有极大的生产潜力[11]。原植物中睡茄素A的含量较低[12]无法满足不断增加的市场需求。国外有将催眠毛状根进行培养条件优化[13]及将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入到催眠睡茄毛状根中以提高睡茄素A的含量[14]来解决睡茄素A的资源短缺问题的相关报道，但效果不显著。因此，本实验利用发根农杆菌C58C1诱导催眠睡茄叶片产生毛状根，同时优化睡茄素A的提取方法，为建立和筛选高效合成睡茄素A的优良毛状根体系奠定基础。
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1 材料
催眠睡茄种子由西南大学梁国鲁教授惠赠。以培养20 d的无菌催眠睡茄幼苗的叶片为外植体。
发根农杆菌C58C1(C58C1 是根癌农杆菌经“Disarmed”改造后，保留Helper 质粒，导入pRiA4 质粒而成的发根农杆菌)由西南大学廖志华教授提供。
岛津 LC-20AD自动进样高效液相色谱仪；睡茄素A对照品购于Nature Remedies Private Limited，(HPLC≥95%)。
2 方法
2.1 C58C1菌株的活化
取发根农杆菌C58C1菌种，于YEB附加40 mg·L-1利福平(Rif)的固体培养基划线培养，挑取单菌落，接种于10 mL附加40 mg·L-1利福平(Rif)的YEB液体培养基中，200 r·min-1，27 ℃振荡培养24 h为第1次活化菌液，取100 μL第1次活化菌液接种于50 mL的YEB附加40 mg·L-1 Rif的液体培养基中，200 r·min-1，27 ℃振荡培养至A600 0.3左右(约12 h)，加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为100 μmol·L-1，继续活化3 h。将50 mL活化好的菌液移入无菌离心管中，4 000 r·min-1，离心10 min，用50 mL附加有100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基重悬菌体，继续于200 r·min-1，27 ℃振荡培养30 min，获得的菌体用于转化催眠睡茄外植体[15]。
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2.2 催眠睡茄毛状根的获得
将处理好的催眠睡茄叶片浸入C58C1的悬浮液中，200 r·min-1，27 ℃振荡20 min后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，接种于附加100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的MS固体培养基中，27 ℃黑暗共培养4～5 d至叶片周围有菌圈出现时，取出叶片，无菌水200 r·min-1振荡洗涤3次，每次10 min，无菌吸水纸吸干水分后接种于附加300 mg·L-1的头孢噻肟钠(Cef)的MS固体培养基中光照培养，每4 d更换1次培养基，直至毛状根长出。
2.3 毛状根的液体培养
当毛状根生长至3 cm左右时，剪下分别接种于含300 mg·L-1的头孢噻肟钠(Cef)的1/2 MS培养基中，每7 d剪取毛状根的根尖继代培养，继代5～6次后，将毛状根转移至YEB琼脂培养基上培养7 d，检测毛状根无农杆菌污染后，接种于1/2 MS液体培养基中，110 r·min-1，27 ℃振荡培养。每20 d左右更换一次培养基，培养30 d左右收获毛状根用于分子检测后，选择性状保持稳定且生长迅速的阳性毛状根克隆进行扩大培养，30 d左右测定睡茄素A的含量。, 百拇医药(王凤英 孙一铭 吕翠萍 程孟琪 张来 孙敏)