基于近红外光谱技术对硫磺熏蒸白芷的定性鉴别和定量研究(1)
[收稿日期] 2014-01-28
[基金项目] 人力资源和社会保障部留学人员科技活动项目(人社厅函[2011]508号)
[通信作者] *巢志茂，研究员，Tel：(010) 64014411-2869，Fax：(010) 64013996，E-mail：chaozhimao@163.com
[作者简介] 吴晓毅，博士研究生，E-mail：wuxiaoyi0000@126.com
[摘要] 白芷中的香豆素类成分在硫磺熏蒸后显著下降，因此需要对硫磺熏蒸的白芷建立快速定性鉴别，并建立欧前胡素含量定量模型，实现药材质量控制的目的。该文使用近红外(NIR)漫反射光谱技术采集硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷的NIR光谱，以一阶导数和矢量归一化的方法进行预处理，采用OPUS/INDENT定性分析软件Ward′s Algorithm法进行聚类分析，在8 806.0～3 811.0 cm-1的聚类分析结果可以简单，快速地鉴别白芷是否被硫磺熏蒸。同时，以高效液相色谱法测定的欧前胡素分析值为参照，结合OPUS/QUANT定量分析软件偏最小二乘法，建立欧前胡素含量的定量模型。该模型的相关系数(R2)，内部交叉验证均方差(RMSECV)和预测均方差(RMSEP)分别为0.982 8，0.006 8和0.011 8。建立的欧前胡素NIR定量模型可准确地用于快速测定白芷中欧前胡素的含量。
, 百拇医药
[关键词] 白芷；近红外光谱；硫磺熏蒸；聚类分析；欧前胡素
中药白芷，为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss.) Shan et Yuan的干燥根。性温味辛，归胃、大肠、肺经，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效，主要用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等[1]。白芷的传统产地加工方法主要采用硫磺熏蒸法，可使药材快速干燥，并解决药材颜色发黄和生虫等问题[2]。但近年来的研究表明，白芷硫磺熏蒸后，其中的香豆素类成分及药效活性均显著降低[3-7]。因此，鉴别硫磺熏蒸样品，并完成白芷的质量控制指标——欧前胡素的含量测定对药材质量控制以及用药规范有重要的意义。当前鉴别硫磺熏蒸药材及饮片的常用检测方法有二氧化硫残留量测定法[8]、改良古蔡氏法[9]、碘滴定-氯化钡反应法[10]等，白芷中欧前胡素的含量常用高效液相色谱法进行测定[1，11]。这些鉴别和测定方法都需要对样品进行损害性处理。近年来，近红外光谱(NIR)技术因具有操作简便、分析速度快、对样品无损害、无化学污染和可实现在线控制的优点，得到了迅速的发展和利用[12]，在药物定性和定量分析中受到了广泛重视和应用[13-15]。本文将近红外技术与化学计量学相结合，采用聚类分析法完成了硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷的分类；同时采用偏最小二乘法建立欧前胡素定量分析模型，实现了白芷中欧前胡素含量的快速、简便和准确测定。这些方便简捷、不损害样品的NIR技术，对白芷具有快速的质量评价价值。
, http://www.100md.com
1 材料
BRUKER MPA 型傅里叶变换近红外光谱仪，配有漫反射附件、样品旋转器和石英样品杯、 PbS检测器、OPUS/INDENT定性分析软件、OPUS/QUANT定量分析软件(德国BRUKER公司)；岛津LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)。
欧前胡素对照品(成都普思生物科技有限公司，批号101228-01)，乙腈、甲醇(色谱纯，Merck公司)，纯水(娃哈哈纯净水)，其他所用试剂均为分析纯。
2012年10月，从河北安国市15个自然村的29个地块随机采挖白芷的根，除去泥土，晾干。每个地块选择大小一致、无病虫害、无机械损伤的白芷6根。其中3根趁新鲜直接切片后晾干，即为非硫磺熏蒸的自然阴干的白芷药材，编号1NS至29NS；另3根进行了48 h的硫磺熏蒸，直到出现"淌泪"为止，即药材变软、表皮有少量液体渗出，达到传统的硫磺熏蒸产地加工的基本要求，随后切片，晾干，即为硫磺熏蒸后的白芷药材，编号为30S至58S，见表1。1NS和30S，2NS和31S，3NS和32S，……以此类推，均为同一个地块的新鲜白芷根的2种不同加工方法获得的实验样本。样品经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定为伞形科当归属植物白芷A. dahurica的根。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 近红外光谱采集
取全部58个样品，粉碎，过80目筛，40 ℃烘12 h，每批样品取4 g，混合均匀后放入石英样品杯中，轻轻振荡使分布均匀，采用积分球漫反射测样，分辨率8 cm-1，扫描64次，扫描范围12 500.0～3 500.0 cm-1，温度(25±1) ℃；相对湿度40%。每批样品重复采集3张光谱，取其平均光谱用于数据处理。58个样品的NIR光谱叠加图见图1。
图1 58个样品的NIR光谱叠加图
Fig.1 The overlapped near-infared spectra of 58 samples
2.2 欧前胡素含量测定
2.2.1 色谱条件 Dikma色谱住[Diamonsil(R)-C18， 4.6 mm×250 mm，5 μm]，柱温35 ℃，流动相乙腈-水(0～10 min，10%～20%乙腈；10～18 min，20%～35%乙腈；18～48 min，35%～55%乙腈；48～68 min，55%～75%乙腈；68～75 min，75%～90%乙腈)，流速1.0 mL·min-1，选用210～800 nm的Max Plot色谱图。, 百拇医药(吴晓毅 巢志茂 孙文 王淳)
[基金项目] 人力资源和社会保障部留学人员科技活动项目(人社厅函[2011]508号)
[通信作者] *巢志茂，研究员，Tel：(010) 64014411-2869，Fax：(010) 64013996，E-mail：chaozhimao@163.com
[作者简介] 吴晓毅，博士研究生，E-mail：wuxiaoyi0000@126.com
[摘要] 白芷中的香豆素类成分在硫磺熏蒸后显著下降，因此需要对硫磺熏蒸的白芷建立快速定性鉴别，并建立欧前胡素含量定量模型，实现药材质量控制的目的。该文使用近红外(NIR)漫反射光谱技术采集硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷的NIR光谱，以一阶导数和矢量归一化的方法进行预处理，采用OPUS/INDENT定性分析软件Ward′s Algorithm法进行聚类分析，在8 806.0～3 811.0 cm-1的聚类分析结果可以简单，快速地鉴别白芷是否被硫磺熏蒸。同时，以高效液相色谱法测定的欧前胡素分析值为参照，结合OPUS/QUANT定量分析软件偏最小二乘法，建立欧前胡素含量的定量模型。该模型的相关系数(R2)，内部交叉验证均方差(RMSECV)和预测均方差(RMSEP)分别为0.982 8，0.006 8和0.011 8。建立的欧前胡素NIR定量模型可准确地用于快速测定白芷中欧前胡素的含量。
, 百拇医药
[关键词] 白芷；近红外光谱；硫磺熏蒸；聚类分析；欧前胡素
中药白芷，为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss.) Shan et Yuan的干燥根。性温味辛，归胃、大肠、肺经，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效，主要用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等[1]。白芷的传统产地加工方法主要采用硫磺熏蒸法，可使药材快速干燥，并解决药材颜色发黄和生虫等问题[2]。但近年来的研究表明，白芷硫磺熏蒸后，其中的香豆素类成分及药效活性均显著降低[3-7]。因此，鉴别硫磺熏蒸样品，并完成白芷的质量控制指标——欧前胡素的含量测定对药材质量控制以及用药规范有重要的意义。当前鉴别硫磺熏蒸药材及饮片的常用检测方法有二氧化硫残留量测定法[8]、改良古蔡氏法[9]、碘滴定-氯化钡反应法[10]等，白芷中欧前胡素的含量常用高效液相色谱法进行测定[1，11]。这些鉴别和测定方法都需要对样品进行损害性处理。近年来，近红外光谱(NIR)技术因具有操作简便、分析速度快、对样品无损害、无化学污染和可实现在线控制的优点，得到了迅速的发展和利用[12]，在药物定性和定量分析中受到了广泛重视和应用[13-15]。本文将近红外技术与化学计量学相结合，采用聚类分析法完成了硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷的分类；同时采用偏最小二乘法建立欧前胡素定量分析模型，实现了白芷中欧前胡素含量的快速、简便和准确测定。这些方便简捷、不损害样品的NIR技术，对白芷具有快速的质量评价价值。
, http://www.100md.com
1 材料
BRUKER MPA 型傅里叶变换近红外光谱仪，配有漫反射附件、样品旋转器和石英样品杯、 PbS检测器、OPUS/INDENT定性分析软件、OPUS/QUANT定量分析软件(德国BRUKER公司)；岛津LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)。
欧前胡素对照品(成都普思生物科技有限公司，批号101228-01)，乙腈、甲醇(色谱纯，Merck公司)，纯水(娃哈哈纯净水)，其他所用试剂均为分析纯。
2012年10月，从河北安国市15个自然村的29个地块随机采挖白芷的根，除去泥土，晾干。每个地块选择大小一致、无病虫害、无机械损伤的白芷6根。其中3根趁新鲜直接切片后晾干，即为非硫磺熏蒸的自然阴干的白芷药材，编号1NS至29NS；另3根进行了48 h的硫磺熏蒸，直到出现"淌泪"为止，即药材变软、表皮有少量液体渗出，达到传统的硫磺熏蒸产地加工的基本要求，随后切片，晾干，即为硫磺熏蒸后的白芷药材，编号为30S至58S，见表1。1NS和30S，2NS和31S，3NS和32S，……以此类推，均为同一个地块的新鲜白芷根的2种不同加工方法获得的实验样本。样品经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定为伞形科当归属植物白芷A. dahurica的根。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 近红外光谱采集
取全部58个样品，粉碎，过80目筛，40 ℃烘12 h，每批样品取4 g，混合均匀后放入石英样品杯中，轻轻振荡使分布均匀，采用积分球漫反射测样，分辨率8 cm-1，扫描64次，扫描范围12 500.0～3 500.0 cm-1，温度(25±1) ℃；相对湿度40%。每批样品重复采集3张光谱，取其平均光谱用于数据处理。58个样品的NIR光谱叠加图见图1。
图1 58个样品的NIR光谱叠加图
Fig.1 The overlapped near-infared spectra of 58 samples
2.2 欧前胡素含量测定
2.2.1 色谱条件 Dikma色谱住[Diamonsil(R)-C18， 4.6 mm×250 mm，5 μm]，柱温35 ℃，流动相乙腈-水(0～10 min，10%～20%乙腈；10～18 min，20%～35%乙腈；18～48 min，35%～55%乙腈；48～68 min，55%～75%乙腈；68～75 min，75%～90%乙腈)，流速1.0 mL·min-1，选用210～800 nm的Max Plot色谱图。, 百拇医药(吴晓毅 巢志茂 孙文 王淳)