菊苣提取物对腹型肥胖大鼠肠道菌群的影响(2)
2.7 标准曲线制作 对4种标准菌株进行普通PCR，反应体系及反应条件同上；对扩增后的产物进行切胶回收、测序，并用紫外测吸光度A及浓度，计算各标准品1 μL拷贝数，用于做标准曲线。将各标准品做10倍系列稀释，使之稀释成为1×102～1×106，然后进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应。反应体系20 μL：SsoAdanced SYBR Green Supermix 10 μL，100 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，DNA模板1 μL；反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，T1(双歧杆菌58 ℃，乳酸菌58 ℃，大肠杆菌60 ℃，肠球菌61 ℃)退火20 s，68 ℃延伸30 s，T2(双歧杆菌85 ℃，乳酸菌83.5 ℃，大肠杆菌85.5 ℃，肠球菌82.5 ℃)保持15 s，双歧杆菌和乳酸菌40个循环，乳酸菌和大肠杆菌30个循环，加溶解曲线：60～90 ℃以0.5 ℃间隔逐渐加热。读取荧光数据和溶解曲线荧光数据 ......
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