华南忍冬绿原酸和木犀草素生物合成关键酶基因表达分析(1)
[摘要] 通过对华南忍冬Lonicera confusa绿原酸?木犀草素生物合成关键酶基因进行组织特异性表达分析，阐明华南忍冬活性成分形成的分子调控机制?采用实时定量PCR分析方法分析绿原酸和木犀草素生物合成途径上的PAL，4CL，C4H，CHS，CHI，FNS，HQT基因家族成员在华南忍冬花蕾和叶中的表达情况?结果表明PAL1，C4H1，4CL1，CHS1，CHI3，HQT2在华南忍冬花蕾中的表达水平要低于叶，而PAL3，4CL2，CHI2，FNS2在花蕾中的表达水平要高于叶?推测华南忍冬PAL3，4CL2基因可能与绿原酸成分积累有关，同时PAL1，CHS1，CHI3，HQT2同源基因在华南忍冬花蕾和叶中的表达模式与忍冬不同，这为进一步研究忍冬与华南忍冬活性成分差异的遗传机制提供理论依据?
[关键词] 华南忍冬；绿原酸；木犀草素；关键酶基因
[收稿日期] 2013-11-28
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81373959，81001605)；中医药行业科研专项(201407003)
, 百拇医药
[通信作者] 袁媛，副研究员，E-mail：yuanyuan@icmm.ac.cn
华南忍冬Lonicera confusa DC.为忍冬科Caprifoliaceae忍冬属半常绿藤本植物，是广东?海南?广西等地山银花药材的主要来源之一，其药用部位为干燥花蕾或带初开的花?作为忍冬藤的替用品，华南忍冬的茎?叶以“银花藤"为名也在临床上使用[1]?华南忍冬含有多种生理活性物质包括有机酸类?黄酮类?挥发油类和三萜类等，其中绿原酸(chlorogenic acid)广泛存在于山银花的花?茎?叶中，具有抗炎?抗氧化?降压?降脂等作用[2-3]?
苯丙氨酸代谢途径上的基因来源于多个基因家族，这些基因的分离鉴定对于研究植物次级代谢上酶的进化方面提供了重要线索[4]?绿原酸生物合成主要通过苯丙氨酸代谢途径[5]，主要分为2步：苯丙氨酸在PAL(phenylalanine ammonia-lyase)，4CL(4-coumarate CoA ligase)，C4H(cinnamate 4-hydroxylase)的作用下形成香豆酰辅酶A(p-Coumaroyl-CoA)；通过HQT(hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase)催化合成绿原酸?香豆酰辅酶A也可以通过CHS(chalcone synthase)，CHI(chalcone isomerase)，FNS(flavone synthase)和一种P450酶催化合成木犀草素[6]?
, 百拇医药
在金银花和山银花中，苯丙氨酸代谢途径上的基因家族成员在不同物种中存在基因功能分化，导致化学成分差异?本课题组已对金银花绿原酸?木犀草素生物合成关键酶基因进行克隆及表达谱分析，并筛选出与绿原酸?木犀草素积累相关的关键酶?在此基础上，本文拟利用华南忍冬新鲜花蕾和叶片，分析其苯丙氨酸代谢途径上关键酶基因家族成员表达谱，为进一步比较忍冬与华南忍冬活性成分?筛选绿原酸积累相关的基因提供依据?
1 材料与方法
1.1 华南忍冬 华南忍冬新鲜花蕾和叶片于2011年5月采自广西?花蕾和叶片各3份样品，分别取自3个不同植株?实验材料样品由余丽莹研究员鉴定，凭证标本保存在广西药用植物园?鉴定后样品保存于-80 ℃冰箱，备用?
1.2 RNA提取 用Trizol Reagent(Invitrogen公司)提取样品总RNA，并加入RNase-Free DNase(Promega公司)进行预处理来消除基因组DNA的污染?用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA无降解后，利用紫外分光光度仪(NanoDrop 2000C)测定总RNA的A260，A280?选择A260/280为1.8～2.0的总RNA进行反转录?
, http://www.100md.com
1.3 反转录及荧光定量PCR 总RNA反转录按反转录试剂盒(Takara公司)进行?定量PCR反应体系参照SYBR premix Ex Taq Kit(Takara公司)说明书，在ABI7500 RT-PCR仪上进行实验?目标基因的检测引物序列见表1，扩增长度为100～250 bp?选择18S基因作为研究华南忍冬花和叶中基因表达的内参，每个样品做3个重复?利用熔解曲线确定目标基因的特异性扩增，使用2-ΔΔCt方法计算目标基因的表达量，以叶为1?
1.4 统计分析 实时荧光定量结果采用SPSS 17.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)，差异显著时进行Tukey′s多重比较，差异显著水平为(P<0.05)，差异极显著水平为(P<0.01)?
2 结果与分析
2.1 PAL基因家族 分别检测了华南忍冬PAL1，PAL2，PAL3基因在花蕾和叶中的表达水平?结果表明PAL1在花中的表达量约是叶中的一半，表达量明显低于叶达到显著水平(P<0.05)?PAL2在花中的表达量略低于叶，没有达到显著水平?PAL3在花中的表达量高于叶，达到显著水平(P<0.05)(图1)?
, http://www.100md.com
2.2 C4H和4CL基因家族 基因表达结果显示C4H1在花中的表达量约是叶中的一半，表达量明显低于叶达到极显著水平(P<0.01)?C4H2在花中的表达量略高于叶，没有达到显著水平?4CL1在花中的表达量低于叶，达到显著水平(P<0.05)?而4CL2在花中的表达水平高于叶，约是叶中表达量的3倍(图2)?
2.3 CHS，CHI，FNS基因家族 基因表达结果表明CHS基因家族中CHS1在花中的表达水平低于叶达到显著水平(P<0.05)，花中的表达量约是叶中的一半，而CHS2在花和叶中的表达水平没有明显差异?CHI基因家族中CHI1在花中的表达水平低于叶，CHI2在花中的表达水平稍高于叶，均未达到显著水平，而CHI3在花中的表达水平低于叶达到极显著水平(P<0.01)?FNS基因家族在花中的表达水平高于叶，其中FNS2在花中的表达量高于叶达到显著水平(P<0.05)(图3)?, http://www.100md.com(秦双双 黄璐琦 袁媛 余丽莹)
[关键词] 华南忍冬；绿原酸；木犀草素；关键酶基因
[收稿日期] 2013-11-28
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81373959，81001605)；中医药行业科研专项(201407003)
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[通信作者] 袁媛，副研究员，E-mail：yuanyuan@icmm.ac.cn
华南忍冬Lonicera confusa DC.为忍冬科Caprifoliaceae忍冬属半常绿藤本植物，是广东?海南?广西等地山银花药材的主要来源之一，其药用部位为干燥花蕾或带初开的花?作为忍冬藤的替用品，华南忍冬的茎?叶以“银花藤"为名也在临床上使用[1]?华南忍冬含有多种生理活性物质包括有机酸类?黄酮类?挥发油类和三萜类等，其中绿原酸(chlorogenic acid)广泛存在于山银花的花?茎?叶中，具有抗炎?抗氧化?降压?降脂等作用[2-3]?
苯丙氨酸代谢途径上的基因来源于多个基因家族，这些基因的分离鉴定对于研究植物次级代谢上酶的进化方面提供了重要线索[4]?绿原酸生物合成主要通过苯丙氨酸代谢途径[5]，主要分为2步：苯丙氨酸在PAL(phenylalanine ammonia-lyase)，4CL(4-coumarate CoA ligase)，C4H(cinnamate 4-hydroxylase)的作用下形成香豆酰辅酶A(p-Coumaroyl-CoA)；通过HQT(hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase)催化合成绿原酸?香豆酰辅酶A也可以通过CHS(chalcone synthase)，CHI(chalcone isomerase)，FNS(flavone synthase)和一种P450酶催化合成木犀草素[6]?
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在金银花和山银花中，苯丙氨酸代谢途径上的基因家族成员在不同物种中存在基因功能分化，导致化学成分差异?本课题组已对金银花绿原酸?木犀草素生物合成关键酶基因进行克隆及表达谱分析，并筛选出与绿原酸?木犀草素积累相关的关键酶?在此基础上，本文拟利用华南忍冬新鲜花蕾和叶片，分析其苯丙氨酸代谢途径上关键酶基因家族成员表达谱，为进一步比较忍冬与华南忍冬活性成分?筛选绿原酸积累相关的基因提供依据?
1 材料与方法
1.1 华南忍冬 华南忍冬新鲜花蕾和叶片于2011年5月采自广西?花蕾和叶片各3份样品，分别取自3个不同植株?实验材料样品由余丽莹研究员鉴定，凭证标本保存在广西药用植物园?鉴定后样品保存于-80 ℃冰箱，备用?
1.2 RNA提取 用Trizol Reagent(Invitrogen公司)提取样品总RNA，并加入RNase-Free DNase(Promega公司)进行预处理来消除基因组DNA的污染?用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA无降解后，利用紫外分光光度仪(NanoDrop 2000C)测定总RNA的A260，A280?选择A260/280为1.8～2.0的总RNA进行反转录?
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1.3 反转录及荧光定量PCR 总RNA反转录按反转录试剂盒(Takara公司)进行?定量PCR反应体系参照SYBR premix Ex Taq Kit(Takara公司)说明书，在ABI7500 RT-PCR仪上进行实验?目标基因的检测引物序列见表1，扩增长度为100～250 bp?选择18S基因作为研究华南忍冬花和叶中基因表达的内参，每个样品做3个重复?利用熔解曲线确定目标基因的特异性扩增，使用2-ΔΔCt方法计算目标基因的表达量，以叶为1?
1.4 统计分析 实时荧光定量结果采用SPSS 17.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)，差异显著时进行Tukey′s多重比较，差异显著水平为(P<0.05)，差异极显著水平为(P<0.01)?
2 结果与分析
2.1 PAL基因家族 分别检测了华南忍冬PAL1，PAL2，PAL3基因在花蕾和叶中的表达水平?结果表明PAL1在花中的表达量约是叶中的一半，表达量明显低于叶达到显著水平(P<0.05)?PAL2在花中的表达量略低于叶，没有达到显著水平?PAL3在花中的表达量高于叶，达到显著水平(P<0.05)(图1)?
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2.2 C4H和4CL基因家族 基因表达结果显示C4H1在花中的表达量约是叶中的一半，表达量明显低于叶达到极显著水平(P<0.01)?C4H2在花中的表达量略高于叶，没有达到显著水平?4CL1在花中的表达量低于叶，达到显著水平(P<0.05)?而4CL2在花中的表达水平高于叶，约是叶中表达量的3倍(图2)?
2.3 CHS，CHI，FNS基因家族 基因表达结果表明CHS基因家族中CHS1在花中的表达水平低于叶达到显著水平(P<0.05)，花中的表达量约是叶中的一半，而CHS2在花和叶中的表达水平没有明显差异?CHI基因家族中CHI1在花中的表达水平低于叶，CHI2在花中的表达水平稍高于叶，均未达到显著水平，而CHI3在花中的表达水平低于叶达到极显著水平(P<0.01)?FNS基因家族在花中的表达水平高于叶，其中FNS2在花中的表达量高于叶达到显著水平(P<0.05)(图3)?, http://www.100md.com(秦双双 黄璐琦 袁媛 余丽莹)