黄连与乌头对lewis肺癌细胞分化的作用比较(1)
[摘要]黄连与乌头分别是寒凉药与温热药的代表，该研究的目的是观察黄连与乌头对lewis肺癌细胞的分化作用，比较寒凉药与温热药对肿瘤进展的影响。该研究制备黄连与乌头大鼠含药血清，体外培养lewis肺癌细胞，观察黄连与乌头含药血清对肿瘤细胞分化、增殖、黏附、琥珀酸脱氢酶活性及细胞间连接通讯的影响。建立小鼠lewis肺癌皮下移植及转移肿瘤模型，采用每日2次、连续4周给小鼠灌胃给药黄连与乌头水煎液治疗，检测小鼠体温、血氧饱和度、红细胞ATP酶活性、血流变、瘤内缺氧状态、毛细血管通透性及细胞间连接通讯，综合评价黄连与乌头对肿瘤进展的影响。结果发现乌头含药血清诱导lewis肺癌细胞分化，抑制细胞增殖和黏附，促进细胞琥珀酸脱氢酶活性及细胞间连接通讯。黄连含药血清虽也抑制细胞增殖，但无诱导细胞分化作用，且促进细胞黏附，抑制细胞琥珀酸脱氢酶活性及细胞间连接通讯。乌头水煎液能维持荷瘤小鼠体温、血氧饱和度、红细胞ATP酶活性和血流变，改善瘤内缺氧状态、毛细血管通透性及细胞间连接通讯，阻止肿瘤生长和转移。黄连水煎液虽也有一定阻止肿瘤生长作用，但降低小鼠体温、血氧饱和度、红细胞ATP酶活性、血流变和细胞间连接通讯，增加瘤内缺氧状态和毛细血管通透性，促进肿瘤转移。这些结果提示温热药可诱导肿瘤肿瘤细胞分化，阻止瘤毒内陷，比寒凉药更有利于肿瘤治疗。
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[关键词]黄连；乌头；肺癌；细胞分化
肺癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，患者的5年生存率仅为 15% 左右，局部复发和远处转移是肺癌患者死亡的主要原因[1]。长期以来人们一直认为， 肿瘤细胞一旦生成就永远是肿瘤细胞。 随着肿瘤细胞可以在某些物质作用下重新向正常细胞方向演变的发现(包括形态功能基因表达及生物学特性诸多标志均与正常细胞接近、甚至完全逆转为正常细胞)，诱导恶性肿瘤细胞向正常或近正常的细胞方向分化逆转成为治疗恶性肿瘤的一种新方法[2]。
中药在防治肿瘤方面有很大的优势，诱导肿瘤细胞分化是中药治疗肿瘤发展的一个新领域[3]。中药诱导肿瘤细胞分化有别于直接杀灭肿瘤细胞的疗法， 对机体正常细胞的负影响较小， 并在毒副作用等问题上优于传统中药。由于药理学研究在很多清热解毒药物中发现了抗癌有效成分，现代中医界在治疗癌症方面形成了重寒凉药而轻温阳药的习惯， 常于处方中投以大队清热解毒、消肿散结之品[4]， 这与黄帝内经将类似于恶性肿瘤的病因责之于寒的认识相违背[5]， 以致造成用药上的偏差， 直接影响了临床疗效。为证实寒凉药与温热药在肿瘤治疗方面的孰是孰非，本研究选择了有抗癌成分的寒凉药黄连和温热药乌头，通过其体内外对小鼠lewis肺癌分化的影响评价寒凉药与温热药对肿瘤治疗的正确与否。
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1材料
1.1药品与试剂 黄连和乌头购自开封市天济堂药店，经河南大学药学院中药鉴定学丛悦教授鉴定，黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎；乌头为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx干燥母根的炮制加工品。黄连和乌头水煎液制备：称取药材300 g，加10倍量水煎煮3次，每次40 min，合并3次煎煮液，反复离心除药渣取上清液，低温浓缩成黄连0.3 g·mL-1，乌头0.2 g·mL-1，-20 ℃储存备用。PMI1640培养基，美国Gibco-BRL；MTT和Matrigel， 美国Sigma公司； 胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所；荧光黄(LY)，上海三浦化工有限公司；粘蛋白MUC1和间隙连接蛋白CX43兔抗鼠多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒(Histostain-Plus)，上海麦约尔生物科技有限公司；琥珀酸脱氢酶活性比色法试剂盒，ATP 酶测试试剂盒，蛋白定量试剂盒，购自南京建成生物公司；小鼠低氧诱导因子1α(HIF-1α)ELISA试剂盒，上海武昊经贸有限公司提供。
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1.2动物与细胞 C57BL/6小鼠，SPF级，雌性，体重(20±2) g，购自北京维通利华试验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)20090002。Wistar大鼠，雌性，体重(250±30) g，购自河南省医学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK( 豫) 2010-0001。动物饲养于河南大学实验动物中心，自由饮食及饮水。
小鼠lewis肺癌细胞(LLC)，购于上海细胞研究所，本实验室传代保存， 生长于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中。
1.3仪器 UV-2000型紫外-可见光分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；LGR16-W型高速冷冻离心机，北京京立离心机有限公司；800型酶标仪，Bio-Tek；XDS-500D型倒置荧光显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司；NDJ-8S型数显旋转式黏度仪，上海平轩科学仪器有限公司；TSAH-100型近红外局部组织血氧饱和度监测仪，合肥安恒光电有限公司。
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2方法
2.1含药血清制备方法 将大鼠随机分为黄连组、乌头组和生理盐水对照组，每组10只。 按2010年版《中国药典》成人(60 kg)最高日剂量(黄连，每日5 g；制乌头，每日3 g)生药约10倍给大鼠灌胃(黄连灌胃日剂量6 g·kg-1，乌头灌胃日剂量4 g·kg-1)，每次给药10 μL·g-1体重 (黄连0.3 g·mL-1、乌头0.2 g·mL-1)，每日2次，连续5 d，生理盐水对照组给以同剂量的生理盐水。 末次灌胃前禁食12 h，灌胃后1 h，颈动脉采血，静置2 h，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，经56 ℃，30 min灭活处理后，用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，置-20 ℃ 保存备用。, 百拇医药(赵贝 侯西栋 李红 戚笑笑 李刚刚 刘霖鑫 王沛 杜钢军)
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[关键词]黄连；乌头；肺癌；细胞分化
肺癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，患者的5年生存率仅为 15% 左右，局部复发和远处转移是肺癌患者死亡的主要原因[1]。长期以来人们一直认为， 肿瘤细胞一旦生成就永远是肿瘤细胞。 随着肿瘤细胞可以在某些物质作用下重新向正常细胞方向演变的发现(包括形态功能基因表达及生物学特性诸多标志均与正常细胞接近、甚至完全逆转为正常细胞)，诱导恶性肿瘤细胞向正常或近正常的细胞方向分化逆转成为治疗恶性肿瘤的一种新方法[2]。
中药在防治肿瘤方面有很大的优势，诱导肿瘤细胞分化是中药治疗肿瘤发展的一个新领域[3]。中药诱导肿瘤细胞分化有别于直接杀灭肿瘤细胞的疗法， 对机体正常细胞的负影响较小， 并在毒副作用等问题上优于传统中药。由于药理学研究在很多清热解毒药物中发现了抗癌有效成分，现代中医界在治疗癌症方面形成了重寒凉药而轻温阳药的习惯， 常于处方中投以大队清热解毒、消肿散结之品[4]， 这与黄帝内经将类似于恶性肿瘤的病因责之于寒的认识相违背[5]， 以致造成用药上的偏差， 直接影响了临床疗效。为证实寒凉药与温热药在肿瘤治疗方面的孰是孰非，本研究选择了有抗癌成分的寒凉药黄连和温热药乌头，通过其体内外对小鼠lewis肺癌分化的影响评价寒凉药与温热药对肿瘤治疗的正确与否。
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1材料
1.1药品与试剂 黄连和乌头购自开封市天济堂药店，经河南大学药学院中药鉴定学丛悦教授鉴定，黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎；乌头为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx干燥母根的炮制加工品。黄连和乌头水煎液制备：称取药材300 g，加10倍量水煎煮3次，每次40 min，合并3次煎煮液，反复离心除药渣取上清液，低温浓缩成黄连0.3 g·mL-1，乌头0.2 g·mL-1，-20 ℃储存备用。PMI1640培养基，美国Gibco-BRL；MTT和Matrigel， 美国Sigma公司； 胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所；荧光黄(LY)，上海三浦化工有限公司；粘蛋白MUC1和间隙连接蛋白CX43兔抗鼠多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒(Histostain-Plus)，上海麦约尔生物科技有限公司；琥珀酸脱氢酶活性比色法试剂盒，ATP 酶测试试剂盒，蛋白定量试剂盒，购自南京建成生物公司；小鼠低氧诱导因子1α(HIF-1α)ELISA试剂盒，上海武昊经贸有限公司提供。
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1.2动物与细胞 C57BL/6小鼠，SPF级，雌性，体重(20±2) g，购自北京维通利华试验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)20090002。Wistar大鼠，雌性，体重(250±30) g，购自河南省医学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK( 豫) 2010-0001。动物饲养于河南大学实验动物中心，自由饮食及饮水。
小鼠lewis肺癌细胞(LLC)，购于上海细胞研究所，本实验室传代保存， 生长于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中。
1.3仪器 UV-2000型紫外-可见光分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；LGR16-W型高速冷冻离心机，北京京立离心机有限公司；800型酶标仪，Bio-Tek；XDS-500D型倒置荧光显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司；NDJ-8S型数显旋转式黏度仪，上海平轩科学仪器有限公司；TSAH-100型近红外局部组织血氧饱和度监测仪，合肥安恒光电有限公司。
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2方法
2.1含药血清制备方法 将大鼠随机分为黄连组、乌头组和生理盐水对照组，每组10只。 按2010年版《中国药典》成人(60 kg)最高日剂量(黄连，每日5 g；制乌头，每日3 g)生药约10倍给大鼠灌胃(黄连灌胃日剂量6 g·kg-1，乌头灌胃日剂量4 g·kg-1)，每次给药10 μL·g-1体重 (黄连0.3 g·mL-1、乌头0.2 g·mL-1)，每日2次，连续5 d，生理盐水对照组给以同剂量的生理盐水。 末次灌胃前禁食12 h，灌胃后1 h，颈动脉采血，静置2 h，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，经56 ℃，30 min灭活处理后，用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，置-20 ℃ 保存备用。, 百拇医药(赵贝 侯西栋 李红 戚笑笑 李刚刚 刘霖鑫 王沛 杜钢军)