PCR反应体系50 μL包括20～50 ng的DNA模板，25 pmol引物，100 μmol·L^-1 dNTPs，2.5 μL的二甲基亚砜(DMSO)以及5 U的Taq DNA聚合酶。采用Touchdown-PCR策略：94 ℃预变性4 min，前20个循环，94 ℃变性45 s，65 ℃退火75 s(每个循环下降0.5 ℃)，72 ℃延伸1 min；后10个循环为94 ℃变性45 s，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸1 min，最后再72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物进行纯化(Axygen DNA分离纯化试剂盒，美国)，-20 ℃冰箱保存。

    1.4 DGGE及测序 利用DGGE(BioRad，美国)分离PCR产物。制备变性梯度胶，使其变性梯度为30%～60%，电泳缓冲液为1×TAE。DGGE电泳条件为：电压160 V，温度60 ℃，时间6.5 h。电泳结束后，SYBR-green I染色30 min，将染色后的DGGE胶用凝胶成像系统Gel Doc 2000(BioRad ......