血小板在活血化瘀中药研究中的应用(1)
[收稿日期] 2013-11-27
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81202886，21275169)
[通信作者] *杨丰庆，副教授，博士生导师，Tel：(023)65106615，E-mail：ysfhqx@hotmail.com
[作者简介] 王凤琴，硕士研究生，E-mail：408524661@qq.com
[摘要] 不同形式的血栓性疾病严重威胁人类的健康，阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板聚集类药物是临床上常用的治疗用药。但随着西药抗血小板聚集药物抵抗性及副作用的出现，传统活血化瘀中药的抗血小板聚集研究逐渐成为一个重要方向。血小板是血栓形成的主要参与者之一，作为生物活性材料在活血化瘀中药研究中扮演着重要角色，主要包括中药抗血小板聚集活性评价及其活性成分筛选2个方面。该文针对近年来血小板在活血化瘀中药研究方面的应用进行了综述，为进一步的研究提供参考。
, 百拇医药
[关键词] 活血化瘀；血小板活化；抗血小板活性评价；活性成分筛选
血瘀证是一类与血液、血液循环有关的病理过程，涉及呼吸、血液、内分泌、循环等多个系统，与心脑血管、肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生、发展有关[1]。活血化瘀中药在治疗血瘀证方面具有悠久的历史，常用的活血化瘀中药有上百种[2]。中医将活血化瘀中药大致分为以下几类[3]：和血药(如丹参、丹皮、生地黄、鸡血藤、当归、赤芍等)、活血药(如川芎、红花、蒲黄、益母草、五灵脂、郁金、三七、大黄、泽兰等)及破血药(如水蛭、血竭、三棱、莪术、桃仁等)。现代医药学研究发现，活血化瘀中药主要通过改善血流动力学、血液流变学、抑制血栓形成、抗动脉粥样硬化及心肌缺血、抑制炎症及肿瘤等过程发挥其活血化瘀作用[4]。
血小板是血液的重要组成部分之一，活化后具有黏附、聚集、释放等功能。当血管壁受损，血小板活化处于正常水平时，血小板能正常参与机体凝血机制[5]。同时，当血小板在受到诱导剂刺激时而致使血小板活化过高，血小板黏附性、聚集性、释放及代谢能力增强，此时血小板过度聚集形成血栓并参与炎症反应等。在血小板活化乃至血栓形成过程中，血小板释放二磷酸腺苷(ADP)和5-羟色胺(5-HT)等生物活性物质能进一步促进血小板的聚集和血栓的形成[6-7]，这会加剧许多病理过程的发生及发展，如动脉粥样硬化、肿瘤转移、冠心病、脑梗死等。因此，抗血小板药物例如阿司匹林在临床上对于心血管疾病的预防和治疗具有重要的作用。然而，近年来此类药物抵抗性及副作用的出现使得人们急需开发新的药效强、副作用小的抗血小板药物，而活血化瘀中药无疑成为此类研究的热点之一[8]。目前，许多活血化瘀中药已被证明具有抗血小板聚集活性，其中比较有代表性的是红花、丹参、川芎、银杏叶、三七、人参、葛根等[9]。近年来，血小板用于活血化瘀中药的研究主要包括2个方面，一是通过检测中药对血小板黏附、聚集、释放等功能的影响来评价中药的抗血小板活性、推断活血化瘀机制；二是通过考察活血化瘀中药成分与血小板膜受体的作用强弱筛选中药中的潜在活血化瘀活性成分。
, 百拇医药
1 血小板用于活血化瘀中药抗血小板活性评价
血小板活化程度过高是形成血栓的主要原因之一。血管受损及一些活化诱导剂(胶原、凝血酶、血小板活化因子、二磷酸腺苷等)均能引起血小板的活化。处于活化状态的血小板的黏附性、聚集性增强。黏附性是指血小板与非血小板表面相互黏附，血小板黏附于血管内壁后即发生聚集反应。血小板聚集是指血小板之间的互相黏着，是血栓形成中较为关键的一步。
活化的血小板的物质代谢会发生显著性变化，主要有：①血小板内颗粒释放的特异性物质增加，包括P-选择素(CD62P、血小板α颗粒膜蛋白140)，β-血小板球蛋白(β-TG)，血小板第4因子(PF4)，CD40L或可溶性CD40L(sCD40L)，GPⅡb/Ⅲa复合物，5-HT，CD63等；②血小板内花生四烯酸代谢增加，包括血栓素A2(TXA2)，血栓素B2(TXB2)及11-脱氢TXB2(11-DH- TXB2)；③血小板活胞内第二内信使钙离子上升及环磷酸腺苷(cAMP)下降。在这些物质中，有的是血小板活化时才表达，可以特异性表征血小板的活化水平，如P-选择素是目前最具特异性的表征血小板活化的分子，被认为是活化血小板标志物的金标准；而有些物质能进一步促进血小板聚集及血栓形成，如5-羟色胺能激活血小板并强化胶原、ADP等对血小板聚集的作用。因此，血小板或血浆内的此类物质的量也被广泛用于评价活血化瘀中药的抗血小板聚集活性，并且比血小板黏附性和聚集性实验更为灵敏。
, http://www.100md.com
中药抗血小板活性评价一般包括体外实验(in vitro)、活体外或离体实验(ex vivo)及体内实验(in vivo)，测试项目包括血小板黏附性、聚集性及相关物质检测，有时还辅助以体内动物血瘀模型实验对评价方法进行验证。活性评价的一般过程是：①实验动物分组给药(体内实验或活体外实验)；②取血，制备富血小板血浆(PRP)或血小板悬液(WP)，并保持一定的血小板浓度；③PRP(WP)中加入诱导剂，分别测试血小板黏附性及聚集性变化；④用相应的酶免疫测定试剂盒、流式细胞术等方法测试血小板释放物及代谢物的改变；⑤血瘀模型相关参数的观察及测定，主要包括出血时间、凝血时间、凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、凝血酶时间等。
近年来，许多文献报道了有关通过检测用药后血小板黏附性、聚集性及血小板相关释放物、代谢物的变化来评价中药抗血小板作用及药理机制研究的方法及应用，研究对象包括传统活血化瘀中药活性成分、单味中药提取物(表1)[10-63]、中药复方(表2)[64-83]、中成药(表3)[84-107]。研究对象大多表现出了体外或(和)体内抑制血小板黏附、聚集及释放、代谢活性；同时，相应的活体内药理辅助实验也证明了此类药物的抗血栓作用。甲磺酸胺银杏内酯B是血小板活化因子拮抗剂银杏内酯B的衍生物。刘成鼎等[10]通过比较空白对照组、各剂量组及阳性对照组中家兔血小板黏附性大小及释放物的含量对其抗血小板作用进行了研究。实验结果显示，甲磺酸胺银杏内酯B能抑制胶原引起的血小板黏附，降低血小板活化因子(PAF)引起的5-HT，β-TG及PF4的释放。这说明甲磺酸钠银杏内酯B具有较好的抗血小板活化作用。并且，相比于银杏内酯B，甲磺酸胺银杏内酯B具有较好的水溶性，可开发为注射液，在一定程度上解决临床上银杏内酯B使用受限的问题。桃红四物汤具有较好的活血化瘀作用，韩岚等[66]采用旋转玻球法、比浊法、酶联免疫吸附法分别测定桃红四物汤对正常及造模血瘀大鼠的血小板黏附性、聚集性及释放物质的变化。结果显示，桃红四物汤能有效地抑制正常大鼠血小板黏附及ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集，降低造模大鼠血浆内vWF，TXB2，GMP-140的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值。说明桃红四物汤对血小板活化过程中黏附、聚集及释放3个阶段均有一定的抑制作用，并由此推断，桃红四物汤的抗血小板活化活性与其能够降低血小板vWF及GMP-140含量，抑制TXB2生成，调节TXB2/6-keto-PGF1α平衡有关。在诸多相似的研究中，香橼[31]、黑豆[62]、西芹[63]等食材也表现出抗血小板活化及抑制血栓形成活性。, 百拇医药(王凤琴 陈岑 夏之宁 杨丰庆)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81202886，21275169)
[通信作者] *杨丰庆，副教授，博士生导师，Tel：(023)65106615，E-mail：ysfhqx@hotmail.com
[作者简介] 王凤琴，硕士研究生，E-mail：408524661@qq.com
[摘要] 不同形式的血栓性疾病严重威胁人类的健康，阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板聚集类药物是临床上常用的治疗用药。但随着西药抗血小板聚集药物抵抗性及副作用的出现，传统活血化瘀中药的抗血小板聚集研究逐渐成为一个重要方向。血小板是血栓形成的主要参与者之一，作为生物活性材料在活血化瘀中药研究中扮演着重要角色，主要包括中药抗血小板聚集活性评价及其活性成分筛选2个方面。该文针对近年来血小板在活血化瘀中药研究方面的应用进行了综述，为进一步的研究提供参考。
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[关键词] 活血化瘀；血小板活化；抗血小板活性评价；活性成分筛选
血瘀证是一类与血液、血液循环有关的病理过程，涉及呼吸、血液、内分泌、循环等多个系统，与心脑血管、肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生、发展有关[1]。活血化瘀中药在治疗血瘀证方面具有悠久的历史，常用的活血化瘀中药有上百种[2]。中医将活血化瘀中药大致分为以下几类[3]：和血药(如丹参、丹皮、生地黄、鸡血藤、当归、赤芍等)、活血药(如川芎、红花、蒲黄、益母草、五灵脂、郁金、三七、大黄、泽兰等)及破血药(如水蛭、血竭、三棱、莪术、桃仁等)。现代医药学研究发现，活血化瘀中药主要通过改善血流动力学、血液流变学、抑制血栓形成、抗动脉粥样硬化及心肌缺血、抑制炎症及肿瘤等过程发挥其活血化瘀作用[4]。
血小板是血液的重要组成部分之一，活化后具有黏附、聚集、释放等功能。当血管壁受损，血小板活化处于正常水平时，血小板能正常参与机体凝血机制[5]。同时，当血小板在受到诱导剂刺激时而致使血小板活化过高，血小板黏附性、聚集性、释放及代谢能力增强，此时血小板过度聚集形成血栓并参与炎症反应等。在血小板活化乃至血栓形成过程中，血小板释放二磷酸腺苷(ADP)和5-羟色胺(5-HT)等生物活性物质能进一步促进血小板的聚集和血栓的形成[6-7]，这会加剧许多病理过程的发生及发展，如动脉粥样硬化、肿瘤转移、冠心病、脑梗死等。因此，抗血小板药物例如阿司匹林在临床上对于心血管疾病的预防和治疗具有重要的作用。然而，近年来此类药物抵抗性及副作用的出现使得人们急需开发新的药效强、副作用小的抗血小板药物，而活血化瘀中药无疑成为此类研究的热点之一[8]。目前，许多活血化瘀中药已被证明具有抗血小板聚集活性，其中比较有代表性的是红花、丹参、川芎、银杏叶、三七、人参、葛根等[9]。近年来，血小板用于活血化瘀中药的研究主要包括2个方面，一是通过检测中药对血小板黏附、聚集、释放等功能的影响来评价中药的抗血小板活性、推断活血化瘀机制；二是通过考察活血化瘀中药成分与血小板膜受体的作用强弱筛选中药中的潜在活血化瘀活性成分。
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1 血小板用于活血化瘀中药抗血小板活性评价
血小板活化程度过高是形成血栓的主要原因之一。血管受损及一些活化诱导剂(胶原、凝血酶、血小板活化因子、二磷酸腺苷等)均能引起血小板的活化。处于活化状态的血小板的黏附性、聚集性增强。黏附性是指血小板与非血小板表面相互黏附，血小板黏附于血管内壁后即发生聚集反应。血小板聚集是指血小板之间的互相黏着，是血栓形成中较为关键的一步。
活化的血小板的物质代谢会发生显著性变化，主要有：①血小板内颗粒释放的特异性物质增加，包括P-选择素(CD62P、血小板α颗粒膜蛋白140)，β-血小板球蛋白(β-TG)，血小板第4因子(PF4)，CD40L或可溶性CD40L(sCD40L)，GPⅡb/Ⅲa复合物，5-HT，CD63等；②血小板内花生四烯酸代谢增加，包括血栓素A2(TXA2)，血栓素B2(TXB2)及11-脱氢TXB2(11-DH- TXB2)；③血小板活胞内第二内信使钙离子上升及环磷酸腺苷(cAMP)下降。在这些物质中，有的是血小板活化时才表达，可以特异性表征血小板的活化水平，如P-选择素是目前最具特异性的表征血小板活化的分子，被认为是活化血小板标志物的金标准；而有些物质能进一步促进血小板聚集及血栓形成，如5-羟色胺能激活血小板并强化胶原、ADP等对血小板聚集的作用。因此，血小板或血浆内的此类物质的量也被广泛用于评价活血化瘀中药的抗血小板聚集活性，并且比血小板黏附性和聚集性实验更为灵敏。
, http://www.100md.com
中药抗血小板活性评价一般包括体外实验(in vitro)、活体外或离体实验(ex vivo)及体内实验(in vivo)，测试项目包括血小板黏附性、聚集性及相关物质检测，有时还辅助以体内动物血瘀模型实验对评价方法进行验证。活性评价的一般过程是：①实验动物分组给药(体内实验或活体外实验)；②取血，制备富血小板血浆(PRP)或血小板悬液(WP)，并保持一定的血小板浓度；③PRP(WP)中加入诱导剂，分别测试血小板黏附性及聚集性变化；④用相应的酶免疫测定试剂盒、流式细胞术等方法测试血小板释放物及代谢物的改变；⑤血瘀模型相关参数的观察及测定，主要包括出血时间、凝血时间、凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、凝血酶时间等。
近年来，许多文献报道了有关通过检测用药后血小板黏附性、聚集性及血小板相关释放物、代谢物的变化来评价中药抗血小板作用及药理机制研究的方法及应用，研究对象包括传统活血化瘀中药活性成分、单味中药提取物(表1)[10-63]、中药复方(表2)[64-83]、中成药(表3)[84-107]。研究对象大多表现出了体外或(和)体内抑制血小板黏附、聚集及释放、代谢活性；同时，相应的活体内药理辅助实验也证明了此类药物的抗血栓作用。甲磺酸胺银杏内酯B是血小板活化因子拮抗剂银杏内酯B的衍生物。刘成鼎等[10]通过比较空白对照组、各剂量组及阳性对照组中家兔血小板黏附性大小及释放物的含量对其抗血小板作用进行了研究。实验结果显示，甲磺酸胺银杏内酯B能抑制胶原引起的血小板黏附，降低血小板活化因子(PAF)引起的5-HT，β-TG及PF4的释放。这说明甲磺酸钠银杏内酯B具有较好的抗血小板活化作用。并且，相比于银杏内酯B，甲磺酸胺银杏内酯B具有较好的水溶性，可开发为注射液，在一定程度上解决临床上银杏内酯B使用受限的问题。桃红四物汤具有较好的活血化瘀作用，韩岚等[66]采用旋转玻球法、比浊法、酶联免疫吸附法分别测定桃红四物汤对正常及造模血瘀大鼠的血小板黏附性、聚集性及释放物质的变化。结果显示，桃红四物汤能有效地抑制正常大鼠血小板黏附及ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集，降低造模大鼠血浆内vWF，TXB2，GMP-140的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值。说明桃红四物汤对血小板活化过程中黏附、聚集及释放3个阶段均有一定的抑制作用，并由此推断，桃红四物汤的抗血小板活化活性与其能够降低血小板vWF及GMP-140含量，抑制TXB2生成，调节TXB2/6-keto-PGF1α平衡有关。在诸多相似的研究中，香橼[31]、黑豆[62]、西芹[63]等食材也表现出抗血小板活化及抑制血栓形成活性。, 百拇医药(王凤琴 陈岑 夏之宁 杨丰庆)