南药植物高良姜内生真菌群体多样性及其组织分布(2)
1.3.3 挥发油含量测定 按《中国药典》(2005年版)[1]附录XD的水蒸气蒸馏法提取挥发油。准确称取约200 g各样品置于挥发油提取装置中,加400 mL水、玻璃珠数粒,加热至沸腾后保持微沸5 h,停止加热后静置1 h,收集蒸馏的馏出物,向其中投入过量无水硫酸钠并充分振荡,使用循环水式真空泵抽滤,得到浅黄色透明油状物,称量、计算挥发油得率。每个样品重复提取3次。1.4 T-RFLP分析
冲洗干净的根茎、根用无菌小刀刮去表皮,切成长、宽、厚各约20 mm小块。剥去表层的茎、及用无菌面棉球反复檫拭过的叶切成长约20 mm小段。按照以下步骤对上述样品进行表面消毒:75%乙醇浸泡(30 s),无菌水冲洗3次,0.1%升汞浸泡(4 min),无菌水冲洗5次。取表面消毒的不同组织小块(10块/组织),于液氮中充分研磨后,用植物基因组DNA提取试剂盒提取各组织总DNA,方法参见试剂盒说明书。每一组织重复提取3次。分别以各组织提取的DNA作为模板,采用真菌核糖体内转录间隔序列(rDNA ITS)通用引物对(正向引物ITS1f ......
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