南药植物高良姜内生真菌群体多样性及其组织分布(1)
[收稿日期] 2014-01-12
[基金项目] 国家自然科学基金项目(31070003)；广州市科技计划项目(2013J4100050)
[通信作者] *李淑彬，教授，Tel/Fax：(020)85215528，E-mail：shuli_1990@126.com
[作者简介] 周仁超，高级实验师，主要研究方向植物与微生物相互作用，E-mail：plantren@126.com
[摘要] 采用组织PCR-末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)免培养技术，从南药植物高良姜道地产地植株根、根茎、茎、叶4个不同组织总共检测到28个不同的末端限制性片段(T-RFs)，说明高良姜内生真菌群体至少组成28个不同的真菌种；不同组织其T-RFLP图谱、T-RFs数目、优势T-RFs组成不同，内生真菌群体Shannon多样性指数和Shannon均匀度指数也随组织而异；采用水蒸气蒸馏法、甲醇抽提-高效液相色谱法测定高良姜主要活性成分挥发油、高良姜素含量，结果显示，该2类活性组分在其根、根茎、茎、叶4个不同组织均有积累，且均以根茎最高；相关性分析显示2类所测活性成分与该宿主内生真菌群体Shannon多样性指数及其均匀度呈极显著的负相关，与325 bp对应于拟盘多毛孢菌属Pestalotiopsis的优势T-RFs呈极显著的正相关。
, 百拇医药
[关键词] 高良姜；内生真菌；末端限制性片段长度多态性；高良姜素；挥发油
高良姜Alpinia officinarum Hance，别名小良姜，又名徐闻良姜，是著名南药植物之一，主治脘腹冷痛、胃寒呕吐，嗳气吞酸[1-2]。高良姜提取物具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗癌、保护脑血管和胃黏膜损伤、改善实验小鼠记忆获得性障碍等多种活性[2-13]，目前除作为世界著名汉药万金油最主要原料外，还广泛用于食品、化妆品和药品添加剂的制备[2-3，9，14]。虽然高良姜在热带、亚热带地区均有分布，但各地高良姜质量和药效存在很大的差异，其中以广东徐闻县龙塘镇所产高良姜质量最优，为道地高良姜[2，15-16]。目前，对高良姜的研究主要集中在对其根茎化学成分分析和制备、药理和药效以及道地高良姜品质鉴定等方面。对高良姜道地性的形成原因尚不清楚。
植物内生真菌(fungal endophytes)是指其生长于健康植物内部、不对寄主产生明显有害影响的真菌。内生真菌存在于目前已研究过的所有植物，其种类、数量都因不同的植物种，同一植物不同组织、不同生长阶段及不同生长环境而不同[17-18]。大量研究已经显示内生真菌不仅能产生结构多样的活性物质[14-17，19-20]，而且可通过多种方式促进宿主生长、提高其对生物及非生物境胁迫的抗性 [17，21-22]。尤其是一些药用植物内生真菌显示了产生与宿主植物相同或相似的活性物质、促进和诱导活性成分合成和积累等有益作用[19，23-28]。研究药用植物内生真菌种群结构及空间、时间动态分布，对建立高质量、高产量的现代中药生产新方法与关键技术、开创中药道地性研究的新思路具有重要意义。
, 百拇医药
内生真菌在禾本科农作物、木本植物及多种药用植物中相继被分离并得到了广泛研究[17-18，20-27，29-31]。然而，对高良姜内生菌的研究目前尚未报道。末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术是近年来新发展的微生物群体多样性分子生态技术[32-34]。本论文以高良姜道地产地广东徐闻龙塘高良姜植株为材料，运用T-RFLP技术研究了高良姜内生真菌多样性及其组织分布特征；同时测定了不同组织中高良姜主要活性成分高良姜素和挥发油的含量；在此基础上，对该植物活性成分与其内生真菌群体的相关性进行了分析，以期为进一步分析内生真菌群体在高良姜道地性形成中的作用、及高良姜内生真菌资源开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 植物
实验所用高良姜采自我国道地高良姜产地广东省湛江市徐闻县龙塘镇。整株挖取生长健壮、无病虫害、约四年生高良姜植株，用灭菌物品袋包裹带回实验室后立即进行组织DNA提取和活性物质抽提。
, 百拇医药
1.2 试剂
高良姜素对照品购于美国Amresco公司；限制性内切酶HhaI，Premix Taq购于Takara公司；植物基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购于上海生工生物科技有限公司；其余试剂为高效液相级或国产分析纯。
1.3 高良姜素和总挥发油的测定
1.3.1 样品处理 用流水洗净高良姜植株表面土壤和其他脏物，剪取其根、根茎、茎和叶样品，恒温干燥箱45 ℃烘干至恒重后，用小型打粉机粉碎、过筛(40目)。
1.3.2 高良姜素含量测定 精密称取高良姜素对照品1 mg，溶于1 mL甲醇中，充分混匀作为母液(1 g·L-1)。母液用甲醇二倍稀释成500，125，62.5，31.25，15.63 mg·L-1。取母液及各稀释度的对照品溶液，高效液相色谱条件：Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%磷酸 60∶40；检测波长 266 nm；流速 1.0 mL · min-1；柱温 30 ℃；进样量10 μL。以进样浓度为横坐标，以峰面积作为纵坐标，得线性方程为y=10.264x+70.082(R2=0.999 4)。样品中高良姜素测定精密称取约20 g样品粉末于100 mL甲醇加热回流1 h，放冷，过滤除渣后补足体积至100 mL，所得甲醇抽提样品用0.22 μm滤膜过滤后，于同样的色谱条件下进行高效液相色谱检测。从高良姜素标准曲线计算出样品中高良姜素量(mg·g-1)。每个样品重复提取3次。, 百拇医药(周仁超 黄娟 李泽恩 李淑彬)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(31070003)；广州市科技计划项目(2013J4100050)
[通信作者] *李淑彬，教授，Tel/Fax：(020)85215528，E-mail：shuli_1990@126.com
[作者简介] 周仁超，高级实验师，主要研究方向植物与微生物相互作用，E-mail：plantren@126.com
[摘要] 采用组织PCR-末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)免培养技术，从南药植物高良姜道地产地植株根、根茎、茎、叶4个不同组织总共检测到28个不同的末端限制性片段(T-RFs)，说明高良姜内生真菌群体至少组成28个不同的真菌种；不同组织其T-RFLP图谱、T-RFs数目、优势T-RFs组成不同，内生真菌群体Shannon多样性指数和Shannon均匀度指数也随组织而异；采用水蒸气蒸馏法、甲醇抽提-高效液相色谱法测定高良姜主要活性成分挥发油、高良姜素含量，结果显示，该2类活性组分在其根、根茎、茎、叶4个不同组织均有积累，且均以根茎最高；相关性分析显示2类所测活性成分与该宿主内生真菌群体Shannon多样性指数及其均匀度呈极显著的负相关，与325 bp对应于拟盘多毛孢菌属Pestalotiopsis的优势T-RFs呈极显著的正相关。
, 百拇医药
[关键词] 高良姜；内生真菌；末端限制性片段长度多态性；高良姜素；挥发油
高良姜Alpinia officinarum Hance，别名小良姜，又名徐闻良姜，是著名南药植物之一，主治脘腹冷痛、胃寒呕吐，嗳气吞酸[1-2]。高良姜提取物具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗癌、保护脑血管和胃黏膜损伤、改善实验小鼠记忆获得性障碍等多种活性[2-13]，目前除作为世界著名汉药万金油最主要原料外，还广泛用于食品、化妆品和药品添加剂的制备[2-3，9，14]。虽然高良姜在热带、亚热带地区均有分布，但各地高良姜质量和药效存在很大的差异，其中以广东徐闻县龙塘镇所产高良姜质量最优，为道地高良姜[2，15-16]。目前，对高良姜的研究主要集中在对其根茎化学成分分析和制备、药理和药效以及道地高良姜品质鉴定等方面。对高良姜道地性的形成原因尚不清楚。
植物内生真菌(fungal endophytes)是指其生长于健康植物内部、不对寄主产生明显有害影响的真菌。内生真菌存在于目前已研究过的所有植物，其种类、数量都因不同的植物种，同一植物不同组织、不同生长阶段及不同生长环境而不同[17-18]。大量研究已经显示内生真菌不仅能产生结构多样的活性物质[14-17，19-20]，而且可通过多种方式促进宿主生长、提高其对生物及非生物境胁迫的抗性 [17，21-22]。尤其是一些药用植物内生真菌显示了产生与宿主植物相同或相似的活性物质、促进和诱导活性成分合成和积累等有益作用[19，23-28]。研究药用植物内生真菌种群结构及空间、时间动态分布，对建立高质量、高产量的现代中药生产新方法与关键技术、开创中药道地性研究的新思路具有重要意义。
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内生真菌在禾本科农作物、木本植物及多种药用植物中相继被分离并得到了广泛研究[17-18，20-27，29-31]。然而，对高良姜内生菌的研究目前尚未报道。末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术是近年来新发展的微生物群体多样性分子生态技术[32-34]。本论文以高良姜道地产地广东徐闻龙塘高良姜植株为材料，运用T-RFLP技术研究了高良姜内生真菌多样性及其组织分布特征；同时测定了不同组织中高良姜主要活性成分高良姜素和挥发油的含量；在此基础上，对该植物活性成分与其内生真菌群体的相关性进行了分析，以期为进一步分析内生真菌群体在高良姜道地性形成中的作用、及高良姜内生真菌资源开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 植物
实验所用高良姜采自我国道地高良姜产地广东省湛江市徐闻县龙塘镇。整株挖取生长健壮、无病虫害、约四年生高良姜植株，用灭菌物品袋包裹带回实验室后立即进行组织DNA提取和活性物质抽提。
, 百拇医药
1.2 试剂
高良姜素对照品购于美国Amresco公司；限制性内切酶HhaI，Premix Taq购于Takara公司；植物基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购于上海生工生物科技有限公司；其余试剂为高效液相级或国产分析纯。
1.3 高良姜素和总挥发油的测定
1.3.1 样品处理 用流水洗净高良姜植株表面土壤和其他脏物，剪取其根、根茎、茎和叶样品，恒温干燥箱45 ℃烘干至恒重后，用小型打粉机粉碎、过筛(40目)。
1.3.2 高良姜素含量测定 精密称取高良姜素对照品1 mg，溶于1 mL甲醇中，充分混匀作为母液(1 g·L-1)。母液用甲醇二倍稀释成500，125，62.5，31.25，15.63 mg·L-1。取母液及各稀释度的对照品溶液，高效液相色谱条件：Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%磷酸 60∶40；检测波长 266 nm；流速 1.0 mL · min-1；柱温 30 ℃；进样量10 μL。以进样浓度为横坐标，以峰面积作为纵坐标，得线性方程为y=10.264x+70.082(R2=0.999 4)。样品中高良姜素测定精密称取约20 g样品粉末于100 mL甲醇加热回流1 h，放冷，过滤除渣后补足体积至100 mL，所得甲醇抽提样品用0.22 μm滤膜过滤后，于同样的色谱条件下进行高效液相色谱检测。从高良姜素标准曲线计算出样品中高良姜素量(mg·g-1)。每个样品重复提取3次。, 百拇医药(周仁超 黄娟 李泽恩 李淑彬)