波棱素脂质体冻干粉针的制备及初步安全性和药效学研究(1)
[收稿日期] 2014-05-17
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81674168)；四川省科学支撑项目(2011FZ0053)；四川省应用基础研究项目(2012JY0027)
[通信作者] *顾健，教授，研究生导师，主要从事中药及民族药物开发与研究，Tel：13882156288， E-mail：gujiancd@163.com
[作者简介] 张鑫，硕士研究生，E-mail：617751077@qq.com
[摘要] 该文研究了波棱素(herpetin， HPT)脂质体冻干粉针剂的制备方法，并对其初步安全性和药效学进行评价。采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液，以包封率、粒径等为评价指标，筛选最佳冻干保护剂；对冻干粉针进行稳定影响因素实验，并初步研究了HPT脂质体冻干粉针的安全性以及对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果。质量分数5%乳糖+5%蔗糖为最佳冻干保护剂，按照最优处方制得的脂质体冻干粉针复水后，平均包封率为(99.70±0.50)%，平均粒径为(107.0±1.2) nm，平均电位为(-6.11±0.72)；脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均较为敏感；脂质体冻干粉针复水后不会引起溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响；HPT脂质体对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果明显，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)指标水平均明显改善，治疗效果明显优于HPT原药。按照最优处方制备的波棱素脂质体冻干粉复水后粒径均匀，包封率符合《中国药典》要求，且具有较高的安全性，能显著提高HPT的治疗效果，保存时应该注意低温、避光、密封保存。
, http://www.100md.com
[关键词] 波棱素；脂质体；粉针剂；安全性；药效学
波棱素(herpetin， HPT)是从藏药波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.子中的木脂素分离出来的活性单体成分。药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[1]。但HPT的水溶性很差，口服生物利用度低，为了克服HPT的上述缺点，并增强其治疗肝脏疾病的效果，作者在前期研究中利用薄膜蒸发法制备HPT脂质体。本研究进一步对HPT脂质体冻干粉针制剂进行筛选，并初步考察了HPT脂质体冻干粉针的安全性及对肝损伤模型动物的治疗效果。
1 材料
Acquity型超高效液相色谱(美国，Waters)；ZS90激光粒度仪(英国，Malvern)；冷冻干燥机；LHH药品稳定性试验箱(上海一恒科学仪器有限公司)；可见分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司)；台式高速离心机TGL-16G(无锡市瑞江分析仪器有限公司)。波棱素对照品(自制，纯度为98.59%)；波棱素原料药(自制，纯度>95%)；大豆卵磷脂购自德国Lipoid公司；胆固醇购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超滤离心管(10 kDa)购自Millpore公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。
, 百拇医药
ICR小鼠，SPF级，体重18～22 g，雄性；家兔，体重1.8～2.2 kg，雄性，均购自于成都达硕实验动物研究中心，动物合格证号分别为SCXK(川)2013-24，SCXK(川)2013-14。
2 方法与结果
2.1 HPT脂质体溶液的制备
根据前期研究结果，采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液[2]：称取波棱素单体24.4 mg、胆固醇195.1 mg、大豆磷脂780.5 mg，置于圆底烧瓶中，加入100 mL氯仿溶解，水浴减压除去氯仿，成膜，加入0.5%泊洛沙姆F68 50 mL脱膜，将得到的类脂膜初悬液水浴超声20 min，过0.22 μm滤膜，即得HPT脂质体溶液。经测定，HPT脂质体平均包封率(94.50±2.15)%，平均粒径(119.2±10.7) nm，多分散系数为0.156±0.075。
, 百拇医药
2.2 冻干粉针处方筛选
选择常用的葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖为冻干保护剂选择不同种类、不同浓度的冻干保护剂，见表1，溶于HPT脂质体溶液中，冷冻干燥后，制得HPT脂质体冻干粉针，观察以下评价指标：①外观及色泽；②再分散性；③粒径；④包封率，筛选出适合的冻干保护剂。选择5%乳糖+5%蔗糖作为复合冻干保护剂，HPT脂质体复水后，粒径最小，包封率最高，外观和再分散性也较好，故选择5%乳糖+5%蔗糖作为HPT脂质体的冻干保护剂。
2.3 初步稳定性研究
取HPT脂质体冻干粉针样品进行影响因素实验考察，分别选取①高温试验条件：40 ℃；②高湿试验条件：相对湿度(RH)75%；③光照试验条件：4 500 lx的光照。将冻干粉针样品分别放置上述条件下，于第5，10天取出样品，观察HPT脂质体冻干粉针变化情况，测定渗漏率，见表2，在40 ℃条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率增加，含量略降低；在相对湿度75%的高湿条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观塌陷，再分散困难，脂质体泄漏率增加；在强光条件下放置后，冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率亦增加，含量亦明显降低。因此，HPT脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均敏感，应低温、密封、避光保存。
, 百拇医药
2.4 溶血试验
取家兔血液10 mL置于含有枸橼酸葡萄糖抗凝的离心管中，4 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，下层红细胞用生理盐水洗涤3次，并按体积比用生理盐水稀释成2%红细胞混悬液。所有试管中均加入红细胞混悬液各2.5 mL，设置样品管、阴性对照试管和阳性对照试管[3]。样品管中分别加入适量HPT脂质体冻干粉针复水液及适量生理盐水，使之HPT脂质体终浓度分别为2%，4%，6%；阴性对照试管仅加入生理盐水；阳性对照试管加入蒸馏水。混匀后，立即将试管置于37 ℃恒温水浴箱水浴30 min后，取出适量样品液离心去除不溶物，于542 nm下测定各样品吸光度，计算溶血率，见表3，HPT脂质体在各个测定浓度下的溶血率均低于5%，可判断HPT脂质体无溶血作用。, 百拇医药(张鑫 谭睿 顾健 何黎黎 章雷 龚普阳)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81674168)；四川省科学支撑项目(2011FZ0053)；四川省应用基础研究项目(2012JY0027)
[通信作者] *顾健，教授，研究生导师，主要从事中药及民族药物开发与研究，Tel：13882156288， E-mail：gujiancd@163.com
[作者简介] 张鑫，硕士研究生，E-mail：617751077@qq.com
[摘要] 该文研究了波棱素(herpetin， HPT)脂质体冻干粉针剂的制备方法，并对其初步安全性和药效学进行评价。采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液，以包封率、粒径等为评价指标，筛选最佳冻干保护剂；对冻干粉针进行稳定影响因素实验，并初步研究了HPT脂质体冻干粉针的安全性以及对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果。质量分数5%乳糖+5%蔗糖为最佳冻干保护剂，按照最优处方制得的脂质体冻干粉针复水后，平均包封率为(99.70±0.50)%，平均粒径为(107.0±1.2) nm，平均电位为(-6.11±0.72)；脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均较为敏感；脂质体冻干粉针复水后不会引起溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响；HPT脂质体对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果明显，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)指标水平均明显改善，治疗效果明显优于HPT原药。按照最优处方制备的波棱素脂质体冻干粉复水后粒径均匀，包封率符合《中国药典》要求，且具有较高的安全性，能显著提高HPT的治疗效果，保存时应该注意低温、避光、密封保存。
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[关键词] 波棱素；脂质体；粉针剂；安全性；药效学
波棱素(herpetin， HPT)是从藏药波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.子中的木脂素分离出来的活性单体成分。药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[1]。但HPT的水溶性很差，口服生物利用度低，为了克服HPT的上述缺点，并增强其治疗肝脏疾病的效果，作者在前期研究中利用薄膜蒸发法制备HPT脂质体。本研究进一步对HPT脂质体冻干粉针制剂进行筛选，并初步考察了HPT脂质体冻干粉针的安全性及对肝损伤模型动物的治疗效果。
1 材料
Acquity型超高效液相色谱(美国，Waters)；ZS90激光粒度仪(英国，Malvern)；冷冻干燥机；LHH药品稳定性试验箱(上海一恒科学仪器有限公司)；可见分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司)；台式高速离心机TGL-16G(无锡市瑞江分析仪器有限公司)。波棱素对照品(自制，纯度为98.59%)；波棱素原料药(自制，纯度>95%)；大豆卵磷脂购自德国Lipoid公司；胆固醇购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超滤离心管(10 kDa)购自Millpore公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。
, 百拇医药
ICR小鼠，SPF级，体重18～22 g，雄性；家兔，体重1.8～2.2 kg，雄性，均购自于成都达硕实验动物研究中心，动物合格证号分别为SCXK(川)2013-24，SCXK(川)2013-14。
2 方法与结果
2.1 HPT脂质体溶液的制备
根据前期研究结果，采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液[2]：称取波棱素单体24.4 mg、胆固醇195.1 mg、大豆磷脂780.5 mg，置于圆底烧瓶中，加入100 mL氯仿溶解，水浴减压除去氯仿，成膜，加入0.5%泊洛沙姆F68 50 mL脱膜，将得到的类脂膜初悬液水浴超声20 min，过0.22 μm滤膜，即得HPT脂质体溶液。经测定，HPT脂质体平均包封率(94.50±2.15)%，平均粒径(119.2±10.7) nm，多分散系数为0.156±0.075。
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2.2 冻干粉针处方筛选
选择常用的葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖为冻干保护剂选择不同种类、不同浓度的冻干保护剂，见表1，溶于HPT脂质体溶液中，冷冻干燥后，制得HPT脂质体冻干粉针，观察以下评价指标：①外观及色泽；②再分散性；③粒径；④包封率，筛选出适合的冻干保护剂。选择5%乳糖+5%蔗糖作为复合冻干保护剂，HPT脂质体复水后，粒径最小，包封率最高，外观和再分散性也较好，故选择5%乳糖+5%蔗糖作为HPT脂质体的冻干保护剂。
2.3 初步稳定性研究
取HPT脂质体冻干粉针样品进行影响因素实验考察，分别选取①高温试验条件：40 ℃；②高湿试验条件：相对湿度(RH)75%；③光照试验条件：4 500 lx的光照。将冻干粉针样品分别放置上述条件下，于第5，10天取出样品，观察HPT脂质体冻干粉针变化情况，测定渗漏率，见表2，在40 ℃条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率增加，含量略降低；在相对湿度75%的高湿条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观塌陷，再分散困难，脂质体泄漏率增加；在强光条件下放置后，冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率亦增加，含量亦明显降低。因此，HPT脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均敏感，应低温、密封、避光保存。
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2.4 溶血试验
取家兔血液10 mL置于含有枸橼酸葡萄糖抗凝的离心管中，4 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，下层红细胞用生理盐水洗涤3次，并按体积比用生理盐水稀释成2%红细胞混悬液。所有试管中均加入红细胞混悬液各2.5 mL，设置样品管、阴性对照试管和阳性对照试管[3]。样品管中分别加入适量HPT脂质体冻干粉针复水液及适量生理盐水，使之HPT脂质体终浓度分别为2%，4%，6%；阴性对照试管仅加入生理盐水；阳性对照试管加入蒸馏水。混匀后，立即将试管置于37 ℃恒温水浴箱水浴30 min后，取出适量样品液离心去除不溶物，于542 nm下测定各样品吸光度，计算溶血率，见表3，HPT脂质体在各个测定浓度下的溶血率均低于5%，可判断HPT脂质体无溶血作用。, 百拇医药(张鑫 谭睿 顾健 何黎黎 章雷 龚普阳)