近红外光谱技术在热毒宁注射液萃取液浓缩过程中的应用研究(1)
[收稿日期] 2014-03-06
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09402203)
[通信作者] *萧伟，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新药的研究与开发，E-mail： wzhzh-nj@163.net
[作者简介] 张亚非，硕士研究生，E-mail：zhangyafei77@163.com
[摘要] 目的：应用近红外(NIR)光谱分析技术，建立热毒宁注射液产业化生产中萃取液浓缩过程绿原酸含量及固含量质量控制指标的快速定量分析方法，实时反映浓缩过程的状态，真正实现萃取液浓缩过程质量控制。方法：收集金青萃取液浓缩过程中样品，经过异常点剔除、光谱预处理和波段选择，运用偏最小二乘法(PLS)分别建立NIR光谱与绿原酸HPLC分析值和固含量之间的定量校正模型，并对未知样品进行预测。结果：绿原酸含量和固含量校正模型的相关系数分别为0.992 1，0.994 0，验证模型的相关系数分别为0.994 4，0.998 4，RMSEC分别为0.814 6，2.656 1，RMSEP分别为0.704 6，1.876 7，RSEP分别为6.01%，2.93%。结论：该方法操作简便、快速无损且准确可靠，可用于热毒宁注射液萃取液浓缩过程中绿原酸含量及固含量的快速监测。
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[关键词] NIR光谱；热毒宁注射液；萃取；绿原酸；固含量
中药浓缩过程是中药生产的关键工艺过程之一，目前，传统的质量控制方法多数以比重值判定浓缩终点，缺乏对整个浓缩过程有效的指标性成分实时监测的手段，无法适应生产过程在线质量控制的需要[1]，易造成不同批次浓缩液质量的不稳定，导致最终产品批次间的质量差异，因此，研究中药浓缩过程的在线质量控制技术具有重要意义。近红外(near-infrared，NIR)光谱技术具有样品处理简单、分析速度快、无需消耗试剂等优点，可实现中药生产过程的在线检测，用于实时监控中药实际生产过程的质量。目前，NIR光谱技术已成功应用于中药生产过程的各个环节[2-8]。
热毒宁注射液是江苏康缘药业股份有限公司研制的原国家二类新药，处方由3味药材组成。本研究首次将NIR光谱分析技术引进热毒宁注射液生产的萃取液浓缩过程，采用偏最小二乘法建立该过程的定量校正模型，实现金青萃取液浓缩过程中绿原酸含量与固含量的快速检测，为实现热毒宁注射液金青萃取液浓缩过程的在线质量监控提供了可行性实验依据与技术保障。
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1 材料
AOTF-NIR光谱仪(BRIMROSE USA)，配套使用SNAP光谱采集软件和CAMO化学计量学软件；Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；AL104-TC电子天平(METTLER)；立鹤牌电热恒温干燥箱(山东潍坊精鹰医疗器械有限公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。
金青萃取浓缩液来自江苏康缘药业股份有限公司热毒宁注射液生产车间，绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110753-200413，纯度>98%)；甲醇(色谱纯，TEDIA；分析纯，南京化学试剂有限公司)；冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
2 方法
2.1 样品收集
根据企业生产实际，金青萃取液浓缩开始后，每隔15 min取样1次，剩余2 h时每隔10 min取样1次，最后1 h每隔5 min取样1次，对样品进行编号，并记录浓缩过程中温度和蒸气压，本实验取样6个批次，分别记为A，B，C，D，E，F批次，每批次根据实际生产情况取样20个左右，共收集123个样品。
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2.2 近红外光谱采集
对收集到的金青萃取液浓缩样品，在恒温水浴锅内加热至恒温(与实际生产浓缩温度保持一致)后，将近红外液体探头伸入样品液中采集样品的透射光谱，设定光谱扫描范围1 100～2 300 nm；波长增量2.0 nm；扫描次数300次；光程5 mm；检测方式为透射，每个样品采集3张光谱，取平均光谱值作为样品的近红外光谱。
2.3 固含量测定
量取10 mL上清液至已烘干至恒重的扁形瓶(X0)，称重(X1)，置烘箱105 ℃条件下烘干至恒重，计X2。固含量(mg·g-1)=(X2-X0)/(X1-X0)。
2.4 绿原酸含量测定
2.4.1 色谱条件 Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相甲醇-1%冰醋酸溶液(20∶80)；进样量10 μL；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长327 nm。方法学考察符合定量分析要求。
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2.4.2 供试品溶液的制备 精密吸取1 mL 浓缩液，用50%甲醇稀释至预实验确定的相应倍数，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。
2.5 光谱数据处理方法与模型性能评价指标
光谱异常点判别后，在适宜光谱预处理基础上，选择合适波段，PLS建立近红外光谱数据与绿原酸含量和固含量2个质量控制指标之间的定量校正模型。CAMO化学计量学软件预测残差平方和(PRESS)的最小值确定最佳主成分数，以相关系数R2，模型的校正集和验证集预测误差均方根(RMSEC，RMSEP)、验证集相对偏差(RSEP)来考察模型性能。
3 结果与讨论
3.1 质量控制指标测定数据
整体上，金青萃取液浓缩过程中固含量和绿原酸含量均随着浓缩过程呈不断增加的趋势，含量分布见表1。按照含量测定值分布范围，验证样品的含量范围需在校正集的含量范围之内，选择E批次所取样品作为验证集，其余样品作为校正集。
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3.2 模型的建立
3.2.1 异常点剔除 实验过程中不可避免引入各种误差，如波长的漂移、操作误差、测量环境等的变化，可能导致样品光谱出现异常，从而引起模型精度的下降。本实验异常值的剔除分别采用三维空间分布值(influence)和线性相关性(correlation)这2个统计量来对照检验剔除，同时参考光谱杠杆值(leverage)，经过异常值的剔除对模型进行优化。influence是指图1-A中的样品三维空间分布图，做定量分析的样品在主成分空间会因光谱性质的相似性而分布的相对集中，而离散在比较远的区域里的少数几个点就是异常值，如图1-A中B-4点。correlation是指图1-B的线性回归视图，图中横坐标是实测值，纵坐标是PLS回归计算过程中交互验证得出的预测值，图中大部分的样品点都分布在离回归线比较近的两侧，有些直接在回归线上，说明预测值与实测值很接近或一致，因此那些离回归线比较远的离散点就是异常值，如图1-B中的B-4点。leverage是指图1-C中的样品杠杆值，通常位于被测组分浓度或性质的均值处的样品杠杆值较小，位于被测组分浓度或性质范围两端的样品具有较大的杠杆值，但在图1-C中明显发现B-4样品的杠杆值远大于其他值，它有可能不代表被测样品的实际情况，故考虑其为异常值，该指标在模型优化时的作用不是太重要，只是作为辅助参考指标。3个指标同时锁定B-4为异常值，故在模型建立前将B-4样品剔除。, http://www.100md.com(张亚非 左翔云 毕宇安 吴建雄 王振中 李萍 萧伟)
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09402203)
[通信作者] *萧伟，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新药的研究与开发，E-mail： wzhzh-nj@163.net
[作者简介] 张亚非，硕士研究生，E-mail：zhangyafei77@163.com
[摘要] 目的：应用近红外(NIR)光谱分析技术，建立热毒宁注射液产业化生产中萃取液浓缩过程绿原酸含量及固含量质量控制指标的快速定量分析方法，实时反映浓缩过程的状态，真正实现萃取液浓缩过程质量控制。方法：收集金青萃取液浓缩过程中样品，经过异常点剔除、光谱预处理和波段选择，运用偏最小二乘法(PLS)分别建立NIR光谱与绿原酸HPLC分析值和固含量之间的定量校正模型，并对未知样品进行预测。结果：绿原酸含量和固含量校正模型的相关系数分别为0.992 1，0.994 0，验证模型的相关系数分别为0.994 4，0.998 4，RMSEC分别为0.814 6，2.656 1，RMSEP分别为0.704 6，1.876 7，RSEP分别为6.01%，2.93%。结论：该方法操作简便、快速无损且准确可靠，可用于热毒宁注射液萃取液浓缩过程中绿原酸含量及固含量的快速监测。
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[关键词] NIR光谱；热毒宁注射液；萃取；绿原酸；固含量
中药浓缩过程是中药生产的关键工艺过程之一，目前，传统的质量控制方法多数以比重值判定浓缩终点，缺乏对整个浓缩过程有效的指标性成分实时监测的手段，无法适应生产过程在线质量控制的需要[1]，易造成不同批次浓缩液质量的不稳定，导致最终产品批次间的质量差异，因此，研究中药浓缩过程的在线质量控制技术具有重要意义。近红外(near-infrared，NIR)光谱技术具有样品处理简单、分析速度快、无需消耗试剂等优点，可实现中药生产过程的在线检测，用于实时监控中药实际生产过程的质量。目前，NIR光谱技术已成功应用于中药生产过程的各个环节[2-8]。
热毒宁注射液是江苏康缘药业股份有限公司研制的原国家二类新药，处方由3味药材组成。本研究首次将NIR光谱分析技术引进热毒宁注射液生产的萃取液浓缩过程，采用偏最小二乘法建立该过程的定量校正模型，实现金青萃取液浓缩过程中绿原酸含量与固含量的快速检测，为实现热毒宁注射液金青萃取液浓缩过程的在线质量监控提供了可行性实验依据与技术保障。
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1 材料
AOTF-NIR光谱仪(BRIMROSE USA)，配套使用SNAP光谱采集软件和CAMO化学计量学软件；Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；AL104-TC电子天平(METTLER)；立鹤牌电热恒温干燥箱(山东潍坊精鹰医疗器械有限公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。
金青萃取浓缩液来自江苏康缘药业股份有限公司热毒宁注射液生产车间，绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110753-200413，纯度>98%)；甲醇(色谱纯，TEDIA；分析纯，南京化学试剂有限公司)；冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
2 方法
2.1 样品收集
根据企业生产实际，金青萃取液浓缩开始后，每隔15 min取样1次，剩余2 h时每隔10 min取样1次，最后1 h每隔5 min取样1次，对样品进行编号，并记录浓缩过程中温度和蒸气压，本实验取样6个批次，分别记为A，B，C，D，E，F批次，每批次根据实际生产情况取样20个左右，共收集123个样品。
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2.2 近红外光谱采集
对收集到的金青萃取液浓缩样品，在恒温水浴锅内加热至恒温(与实际生产浓缩温度保持一致)后，将近红外液体探头伸入样品液中采集样品的透射光谱，设定光谱扫描范围1 100～2 300 nm；波长增量2.0 nm；扫描次数300次；光程5 mm；检测方式为透射，每个样品采集3张光谱，取平均光谱值作为样品的近红外光谱。
2.3 固含量测定
量取10 mL上清液至已烘干至恒重的扁形瓶(X0)，称重(X1)，置烘箱105 ℃条件下烘干至恒重，计X2。固含量(mg·g-1)=(X2-X0)/(X1-X0)。
2.4 绿原酸含量测定
2.4.1 色谱条件 Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相甲醇-1%冰醋酸溶液(20∶80)；进样量10 μL；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长327 nm。方法学考察符合定量分析要求。
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2.4.2 供试品溶液的制备 精密吸取1 mL 浓缩液，用50%甲醇稀释至预实验确定的相应倍数，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。
2.5 光谱数据处理方法与模型性能评价指标
光谱异常点判别后，在适宜光谱预处理基础上，选择合适波段，PLS建立近红外光谱数据与绿原酸含量和固含量2个质量控制指标之间的定量校正模型。CAMO化学计量学软件预测残差平方和(PRESS)的最小值确定最佳主成分数，以相关系数R2，模型的校正集和验证集预测误差均方根(RMSEC，RMSEP)、验证集相对偏差(RSEP)来考察模型性能。
3 结果与讨论
3.1 质量控制指标测定数据
整体上，金青萃取液浓缩过程中固含量和绿原酸含量均随着浓缩过程呈不断增加的趋势，含量分布见表1。按照含量测定值分布范围，验证样品的含量范围需在校正集的含量范围之内，选择E批次所取样品作为验证集，其余样品作为校正集。
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3.2 模型的建立
3.2.1 异常点剔除 实验过程中不可避免引入各种误差，如波长的漂移、操作误差、测量环境等的变化，可能导致样品光谱出现异常，从而引起模型精度的下降。本实验异常值的剔除分别采用三维空间分布值(influence)和线性相关性(correlation)这2个统计量来对照检验剔除，同时参考光谱杠杆值(leverage)，经过异常值的剔除对模型进行优化。influence是指图1-A中的样品三维空间分布图，做定量分析的样品在主成分空间会因光谱性质的相似性而分布的相对集中，而离散在比较远的区域里的少数几个点就是异常值，如图1-A中B-4点。correlation是指图1-B的线性回归视图，图中横坐标是实测值，纵坐标是PLS回归计算过程中交互验证得出的预测值，图中大部分的样品点都分布在离回归线比较近的两侧，有些直接在回归线上，说明预测值与实测值很接近或一致，因此那些离回归线比较远的离散点就是异常值，如图1-B中的B-4点。leverage是指图1-C中的样品杠杆值，通常位于被测组分浓度或性质的均值处的样品杠杆值较小，位于被测组分浓度或性质范围两端的样品具有较大的杠杆值，但在图1-C中明显发现B-4样品的杠杆值远大于其他值，它有可能不代表被测样品的实际情况，故考虑其为异常值，该指标在模型优化时的作用不是太重要，只是作为辅助参考指标。3个指标同时锁定B-4为异常值，故在模型建立前将B-4样品剔除。, http://www.100md.com(张亚非 左翔云 毕宇安 吴建雄 王振中 李萍 萧伟)