超声辅助酶解人参总皂苷制备人参稀有皂苷Compound K的研究(1)
[收稿日期] 2014-02-21
[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目(2008BAI51B03)；国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室开放基金课题(2011NDDCM01002)
[通信作者] *贾晓斌，Tel/Fax：(025) 85637809，E-mail：jiaxiaobinpharmacy@126.com
[作者简介] 于兆慧，硕士研究生，Tel：(025)85608672，E-mail：yuzhaohui0415@126.com
[摘要] 该实验采用超声辅助酶解人参总皂苷以制备人参稀有皂苷Compound K。以转化率为指标，通过单因素考察超声功率、超声时间等超声预处理因素和pH、温度、底物浓度、酶用量、反应时间等酶解因素对转化率的影响，并应用响应面法试验优化制备工艺；采用MS，/1H，13C-NMR鉴定酶解产物。结果表明，超声辅助酶解反应的最适条件为超声功率250 W，超声时间15 min，酶解pH 5.5，酶解温度50 ℃，酶解时间36 h，酶用量-底物4∶5，底物质量浓度1.0 g·L-1；反应产物相对分子质量622.4，核磁图谱证实产物为人参稀有皂苷Compound K。在此条件下，以人参总皂苷计，人参稀有皂苷Compound K转化率为6.91%。该工艺反应条件温和，转化率较高，工艺简单可靠，适合工业化生产。
, 百拇医药
[关键词] 人参总皂苷；人参稀有皂苷Compound K；超声辅助；酶解；响应面法
人参稀有皂苷Compound K(CK)是五加科人参属植物人参的一种二醇型稀有人参皂苷，被世界各个国家广泛用于疾病的预防和治疗[1]。近年来研究发现，人参稀有皂苷CK在抗肿瘤、抗糖尿病、神经保护、抗衰老及抗炎等方面都具有明显的作用[2-8]。但CK在植物中的含量较低，单纯分离提取难以满足应用需求[9]。大量研究表明，人参二醇型皂苷在人参总皂苷中含量较高，且人参皂苷二醇组可以通过生物转化得到CK[10-12]，因此可以通过酶解的方法得到CK。生物酶解技术具有选择性高、反应条件温和、转化率高、分离纯化容易、对环境无污染及成本低廉等优点[13]，近年来在中药活性成分制备中已经具有了一定的研究价值。以蜗牛酶等水解中药提取物及中药单体成分中的糖苷键，可制备具有较高活性的低级苷或苷元[14-15]。本文研究超声辅助酶解人参总皂苷，利用超声波的空化效应、热效应和机械振动等作用[16]，促使底物与酶充分结合，从而提高酶解转化率。另外，本文采用蜗牛酶酶解人参总皂苷制备CK，大大降低实验成本，更利于工业化生产。因此，本实验对人参稀有皂苷CK的规模化制备具有重要的理论意义，并在一定程度上为CK 的产业化提供了实验基础。
, 百拇医药
1 材料
Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)；UV-2201型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；数显气浴恒温振荡器(金坛市双捷实验仪器厂)；SK8210 HP型功率可调超声波清洗机(南京以马内利仪器设备有限公司)；Mettler AL204 1/10万天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ；精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)；瑞士Bruker(AV 300)核磁共振仪，溶剂为氘代DMSO。
人参总皂苷(南京泽朗医药科技有限公司)；人参皂苷Re(中国食品药品检定研究院)；人参稀有皂苷Compund K (自制，纯度>98%)；蜗牛酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 人参总皂苷的含量测定
, http://www.100md.com
2.1.1 标准曲线制备[17] 精密称定人参皂苷Re对照品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取人参皂苷Re对照品溶液10，20，30，40，50 μL分别置10 mL带塞试管中，将试管置于冰水浴中，分别加入40，30，20，10，0 μL甲醇后，再加入85%香草醛乙醇溶液0.5 mL ，77%硫酸5.0 mL，摇匀，混合物置60 ℃恒温水浴中加热10 min后，立即在冰水中冷却15 min，并在另一试管中加甲醇50 μL，加随行试剂，作为空白对照，显色溶液在(546±1) nm波长处测定吸收值，求得回归方程Y=0.004 1X +0.017 2，R2=0.999 9。
2.1.2 人参总皂苷的含量测定 取人参总皂苷提取物10 mg，精密称定，按2.1.1项操作，测定吸光值，计算人参总皂苷的含量，结果平均质量分数为8.79 g·L-1，RSD 2.2%。
2.2 人参稀有皂苷CK转化率的测定
, http://www.100md.com
2.2.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，0～8 min，40% A；8～35 min，64.3% A；35～45 min，40% A；检测波长203 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备 取人参稀有皂苷CK 10.0 mg，精密称定，置于10 mL具塞量瓶中，加适量无水乙醇溶解，并定容至刻度，超声除去气泡，再用无水乙醇补足至刻度，即得1.15 g·L-1人参稀有皂苷CK对照品储备液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取一定量的人参总皂苷和蜗牛酶，加入一定pH的缓冲溶液定容至10 mL，在一定功率的超声仪中超声一段时间，放入数显气浴恒温振荡器，调节转速(150±5) r·min-1，在一定温度下反应一段时间，即得供试品的混悬溶液。, http://www.100md.com(于兆慧 刘其媛 崔莉 贾晓斌 金鑫 张振海)
[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目(2008BAI51B03)；国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室开放基金课题(2011NDDCM01002)
[通信作者] *贾晓斌，Tel/Fax：(025) 85637809，E-mail：jiaxiaobinpharmacy@126.com
[作者简介] 于兆慧，硕士研究生，Tel：(025)85608672，E-mail：yuzhaohui0415@126.com
[摘要] 该实验采用超声辅助酶解人参总皂苷以制备人参稀有皂苷Compound K。以转化率为指标，通过单因素考察超声功率、超声时间等超声预处理因素和pH、温度、底物浓度、酶用量、反应时间等酶解因素对转化率的影响，并应用响应面法试验优化制备工艺；采用MS，/1H，13C-NMR鉴定酶解产物。结果表明，超声辅助酶解反应的最适条件为超声功率250 W，超声时间15 min，酶解pH 5.5，酶解温度50 ℃，酶解时间36 h，酶用量-底物4∶5，底物质量浓度1.0 g·L-1；反应产物相对分子质量622.4，核磁图谱证实产物为人参稀有皂苷Compound K。在此条件下，以人参总皂苷计，人参稀有皂苷Compound K转化率为6.91%。该工艺反应条件温和，转化率较高，工艺简单可靠，适合工业化生产。
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[关键词] 人参总皂苷；人参稀有皂苷Compound K；超声辅助；酶解；响应面法
人参稀有皂苷Compound K(CK)是五加科人参属植物人参的一种二醇型稀有人参皂苷，被世界各个国家广泛用于疾病的预防和治疗[1]。近年来研究发现，人参稀有皂苷CK在抗肿瘤、抗糖尿病、神经保护、抗衰老及抗炎等方面都具有明显的作用[2-8]。但CK在植物中的含量较低，单纯分离提取难以满足应用需求[9]。大量研究表明，人参二醇型皂苷在人参总皂苷中含量较高，且人参皂苷二醇组可以通过生物转化得到CK[10-12]，因此可以通过酶解的方法得到CK。生物酶解技术具有选择性高、反应条件温和、转化率高、分离纯化容易、对环境无污染及成本低廉等优点[13]，近年来在中药活性成分制备中已经具有了一定的研究价值。以蜗牛酶等水解中药提取物及中药单体成分中的糖苷键，可制备具有较高活性的低级苷或苷元[14-15]。本文研究超声辅助酶解人参总皂苷，利用超声波的空化效应、热效应和机械振动等作用[16]，促使底物与酶充分结合，从而提高酶解转化率。另外，本文采用蜗牛酶酶解人参总皂苷制备CK，大大降低实验成本，更利于工业化生产。因此，本实验对人参稀有皂苷CK的规模化制备具有重要的理论意义，并在一定程度上为CK 的产业化提供了实验基础。
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1 材料
Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)；UV-2201型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；数显气浴恒温振荡器(金坛市双捷实验仪器厂)；SK8210 HP型功率可调超声波清洗机(南京以马内利仪器设备有限公司)；Mettler AL204 1/10万天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ；精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)；瑞士Bruker(AV 300)核磁共振仪，溶剂为氘代DMSO。
人参总皂苷(南京泽朗医药科技有限公司)；人参皂苷Re(中国食品药品检定研究院)；人参稀有皂苷Compund K (自制，纯度>98%)；蜗牛酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 人参总皂苷的含量测定
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2.1.1 标准曲线制备[17] 精密称定人参皂苷Re对照品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取人参皂苷Re对照品溶液10，20，30，40，50 μL分别置10 mL带塞试管中，将试管置于冰水浴中，分别加入40，30，20，10，0 μL甲醇后，再加入85%香草醛乙醇溶液0.5 mL ，77%硫酸5.0 mL，摇匀，混合物置60 ℃恒温水浴中加热10 min后，立即在冰水中冷却15 min，并在另一试管中加甲醇50 μL，加随行试剂，作为空白对照，显色溶液在(546±1) nm波长处测定吸收值，求得回归方程Y=0.004 1X +0.017 2，R2=0.999 9。
2.1.2 人参总皂苷的含量测定 取人参总皂苷提取物10 mg，精密称定，按2.1.1项操作，测定吸光值，计算人参总皂苷的含量，结果平均质量分数为8.79 g·L-1，RSD 2.2%。
2.2 人参稀有皂苷CK转化率的测定
, http://www.100md.com
2.2.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，0～8 min，40% A；8～35 min，64.3% A；35～45 min，40% A；检测波长203 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL。
2.2.2 对照品溶液的制备 取人参稀有皂苷CK 10.0 mg，精密称定，置于10 mL具塞量瓶中，加适量无水乙醇溶解，并定容至刻度，超声除去气泡，再用无水乙醇补足至刻度，即得1.15 g·L-1人参稀有皂苷CK对照品储备液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取一定量的人参总皂苷和蜗牛酶，加入一定pH的缓冲溶液定容至10 mL，在一定功率的超声仪中超声一段时间，放入数显气浴恒温振荡器，调节转速(150±5) r·min-1，在一定温度下反应一段时间，即得供试品的混悬溶液。, http://www.100md.com(于兆慧 刘其媛 崔莉 贾晓斌 金鑫 张振海)