裸花紫珠化学成分及细胞毒活性研究(1)
[收稿日期] 2014-04-26
[基金项目] 海南省中药现代化专项基金(ZY201328)；海南省社会发展科技专项(SF201315)；深圳市科技创新委项目(JCYJ201206153136998)
[通信作者] *易博，副主任药师，主要研究中药现代化及医院药学，Tel：(0898)65920079，Fax：(0898)65920380，E-mail：boyicn@126.com；*雷鸣，教授，主要研究肿瘤学，E-mail：mayanchun85@163.com
[作者简介] 马燕春，博士研究生，Tel：13572140149，E-mail：329825603@qq.com
[摘要] 综合运用HP-20大孔吸附树脂柱粗分、硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱等色谱法分离纯化海南道地药材裸花紫珠Callicarpa nudiflora 中的化学成分，借助波谱数据解析化合物的结构。采用MTT法测定其粗提物和单体化合物的细胞毒活性。发现裸花紫珠醇提物50%，70%乙醇洗脱物对肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用。从上述活性部位分离和鉴定得到12个化合物，其中6个黄酮：木犀草苷(1)，木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)，6-羟基木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)，木犀草素-7-O-新橙皮苷(4)，野漆树苷(5)，木犀草素-7， 4′-二-O-葡萄糖苷(6)；3个苯乙醇苷：连翘酯苷(7)，类叶升麻苷(8)，alyssonoside(9)；3个环烯醚萜苷：梓醇(10)，nudifloside(11)，益母草苷(12)。化合物3～6，10和12为首次从该属植物中分离得到，化合物9为首次从该种植物中分离得到。单体化合物的细胞毒活性实验显示，黄酮类化合物1～6整体均显示出对宫颈癌Hela，肺癌A549和乳腺癌MCF-7细胞不同程度的抑制作用，化合物3，5和11的细胞毒活性比较突出。综合分析表明，黄酮类化合物是裸花紫珠活性部位的主要化学成分，有抑制肿瘤细胞增殖的潜在功效；苯乙醇苷类化合物含量较高，但不表现细胞毒活性；环烯醚萜苷类成分少量存在，表现出微弱的细胞毒活性。
, http://www.100md.com
[关键词] 裸花紫珠；细胞毒；化学成分
裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook. Et Am为马鞭草科紫珠属植物，是海南省的地道药材，广泛分布于我国的海南省，广东和广西等省，以其干燥地上部分入药，主要具有止血、祛瘀和止痛功效[1-3]。近年来，围绕其止血活性成分和相关机制研究中，已报道了部分黄酮、萜类和苯丙素类等成分，并推测其通过内源性凝血途径来发挥止血作用[4]；同时裸花紫珠还有消炎和解毒的作用，可用于治疗化脓性炎症[1]。研究认为，炎症的恶化往往会促进细胞癌变，甚至引发癌症，导致侵袭和转移的发生，因此癌症也可以被视为一个炎症过程，并且具有抗炎作用的中草药大多含有抗癌活性成分[5-9]。已有文献报道，裸花紫珠的地上部分的醇提物对慢性白血病骨髓瘤K562细胞有抑制作用[10]，然而少有对其活性部位及化学成分的细胞毒活性研究，因此探索其中的活性物质具有重要的研究价值。
, 百拇医药
本研究首先对裸花紫珠醇提物进行大孔吸附树脂处理，依次用30%，50%，70%，90%，100%乙醇水进行洗脱，分别测定所得的5个流分对宫颈癌细胞株Hela，乳腺癌细胞株MCF-7和非小细胞肺癌细胞株A549的抑制率，筛选出可显著抑制肿瘤细胞增殖的活性部位。然后对其化学成分进行分离鉴定，获得了6个黄酮苷类，3个苯丙素苷类和3个环烯醚萜类共12个化合物。最后对分离得到的单体化合物进行了细胞毒活性测定，以进一步明确裸花紫珠抑制肿瘤细胞增殖的化学物质基础。
1 材料
1.1 药材 裸花紫珠药材于2013年4月采自海南省五指山，经深圳市中科院仙湖植物园陈涛研究员鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠C. nudiflora，材料自然风干，地上部位粉碎后备用。
1.2 细胞株 实验所用的人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7和人非小细胞肺癌细胞株A549均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
, 百拇医药
1.3 试剂与仪器 Bruker AVANCE 500型超导核磁共振仪，LCQ DECA XP型质谱仪(美国Thermo)，精密天平(德国Sartorius)，制备薄层硅胶板、硅胶薄层色谱板 GF254和柱色谱硅胶80～100，100～200和200～300目(青岛谱科分离材料有限公司)，Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶和大孔吸附树脂HP-20(日本三菱化工有限公司)，氘代试剂CD3OD和DMSO-d6(美国剑桥公司CIL)，RPMI 1640培养基(Gibco公司)；DMEM 培养基(Gibco公司)，FBS(杭州四季青生物工程有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，紫杉醇(Taxol，Tocris Bioscience公司)，恒温CO2细胞培养箱(日本三洋SANYO公司)，其他试剂均为分析纯。
2 提取与分离
裸花紫珠2.5 kg，粉碎后经95%乙醇浸泡3次，每次48 h，将提取液过滤合并，旋转蒸发仪减压浓缩得总浸膏(415.0 g)。浸膏经HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用30%，50%，70%，90%，100%乙醇洗脱，每个浓度洗脱3个柱体积，减压浓缩洗脱液，分别记作HP-1～HP-5。体外细胞毒活性测定表明HP-3和HP-4有显著的细胞毒活性，选择对HP-3和HP-4组分进行系统的化学成分研究。
, 百拇医药
HP-3(79.0 g)经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 9∶1～2∶1)梯度洗脱，TLC检测合并相同组分得Frs.A～G共7个流分。Fr.B(9.8 g)经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 5∶1～4∶1)，得10个小流分(Frs.B1～10)。Frs.B3～B5中有沉淀析出，过滤沉淀后，滤液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化(甲醇)，得化合物1(228.3 mg)，2(32.1 mg)。Fr.C(1.5 g)先后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇：氯仿 3∶1)和硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 5∶1～3∶1)多次纯化得化合物9(119.6 mg)，5(3.73 mg)。Fr.E(2.3 g)和Fr.F(2.8 g)合并后，经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 5∶1～4∶1)分离，所得主体部分再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)纯化，得化合物3(67.5 mg)，4(16.3 mg)，6(12.9 mg)。, 百拇医药(马燕春 张旻 徐文彤 冯世秀 雷鸣 易博)
[基金项目] 海南省中药现代化专项基金(ZY201328)；海南省社会发展科技专项(SF201315)；深圳市科技创新委项目(JCYJ201206153136998)
[通信作者] *易博，副主任药师，主要研究中药现代化及医院药学，Tel：(0898)65920079，Fax：(0898)65920380，E-mail：boyicn@126.com；*雷鸣，教授，主要研究肿瘤学，E-mail：mayanchun85@163.com
[作者简介] 马燕春，博士研究生，Tel：13572140149，E-mail：329825603@qq.com
[摘要] 综合运用HP-20大孔吸附树脂柱粗分、硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱等色谱法分离纯化海南道地药材裸花紫珠Callicarpa nudiflora 中的化学成分，借助波谱数据解析化合物的结构。采用MTT法测定其粗提物和单体化合物的细胞毒活性。发现裸花紫珠醇提物50%，70%乙醇洗脱物对肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用。从上述活性部位分离和鉴定得到12个化合物，其中6个黄酮：木犀草苷(1)，木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)，6-羟基木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)，木犀草素-7-O-新橙皮苷(4)，野漆树苷(5)，木犀草素-7， 4′-二-O-葡萄糖苷(6)；3个苯乙醇苷：连翘酯苷(7)，类叶升麻苷(8)，alyssonoside(9)；3个环烯醚萜苷：梓醇(10)，nudifloside(11)，益母草苷(12)。化合物3～6，10和12为首次从该属植物中分离得到，化合物9为首次从该种植物中分离得到。单体化合物的细胞毒活性实验显示，黄酮类化合物1～6整体均显示出对宫颈癌Hela，肺癌A549和乳腺癌MCF-7细胞不同程度的抑制作用，化合物3，5和11的细胞毒活性比较突出。综合分析表明，黄酮类化合物是裸花紫珠活性部位的主要化学成分，有抑制肿瘤细胞增殖的潜在功效；苯乙醇苷类化合物含量较高，但不表现细胞毒活性；环烯醚萜苷类成分少量存在，表现出微弱的细胞毒活性。
, http://www.100md.com
[关键词] 裸花紫珠；细胞毒；化学成分
裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook. Et Am为马鞭草科紫珠属植物，是海南省的地道药材，广泛分布于我国的海南省，广东和广西等省，以其干燥地上部分入药，主要具有止血、祛瘀和止痛功效[1-3]。近年来，围绕其止血活性成分和相关机制研究中，已报道了部分黄酮、萜类和苯丙素类等成分，并推测其通过内源性凝血途径来发挥止血作用[4]；同时裸花紫珠还有消炎和解毒的作用，可用于治疗化脓性炎症[1]。研究认为，炎症的恶化往往会促进细胞癌变，甚至引发癌症，导致侵袭和转移的发生，因此癌症也可以被视为一个炎症过程，并且具有抗炎作用的中草药大多含有抗癌活性成分[5-9]。已有文献报道，裸花紫珠的地上部分的醇提物对慢性白血病骨髓瘤K562细胞有抑制作用[10]，然而少有对其活性部位及化学成分的细胞毒活性研究，因此探索其中的活性物质具有重要的研究价值。
, 百拇医药
本研究首先对裸花紫珠醇提物进行大孔吸附树脂处理，依次用30%，50%，70%，90%，100%乙醇水进行洗脱，分别测定所得的5个流分对宫颈癌细胞株Hela，乳腺癌细胞株MCF-7和非小细胞肺癌细胞株A549的抑制率，筛选出可显著抑制肿瘤细胞增殖的活性部位。然后对其化学成分进行分离鉴定，获得了6个黄酮苷类，3个苯丙素苷类和3个环烯醚萜类共12个化合物。最后对分离得到的单体化合物进行了细胞毒活性测定，以进一步明确裸花紫珠抑制肿瘤细胞增殖的化学物质基础。
1 材料
1.1 药材 裸花紫珠药材于2013年4月采自海南省五指山，经深圳市中科院仙湖植物园陈涛研究员鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠C. nudiflora，材料自然风干，地上部位粉碎后备用。
1.2 细胞株 实验所用的人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MCF-7和人非小细胞肺癌细胞株A549均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
, 百拇医药
1.3 试剂与仪器 Bruker AVANCE 500型超导核磁共振仪，LCQ DECA XP型质谱仪(美国Thermo)，精密天平(德国Sartorius)，制备薄层硅胶板、硅胶薄层色谱板 GF254和柱色谱硅胶80～100，100～200和200～300目(青岛谱科分离材料有限公司)，Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶和大孔吸附树脂HP-20(日本三菱化工有限公司)，氘代试剂CD3OD和DMSO-d6(美国剑桥公司CIL)，RPMI 1640培养基(Gibco公司)；DMEM 培养基(Gibco公司)，FBS(杭州四季青生物工程有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，紫杉醇(Taxol，Tocris Bioscience公司)，恒温CO2细胞培养箱(日本三洋SANYO公司)，其他试剂均为分析纯。
2 提取与分离
裸花紫珠2.5 kg，粉碎后经95%乙醇浸泡3次，每次48 h，将提取液过滤合并，旋转蒸发仪减压浓缩得总浸膏(415.0 g)。浸膏经HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用30%，50%，70%，90%，100%乙醇洗脱，每个浓度洗脱3个柱体积，减压浓缩洗脱液，分别记作HP-1～HP-5。体外细胞毒活性测定表明HP-3和HP-4有显著的细胞毒活性，选择对HP-3和HP-4组分进行系统的化学成分研究。
, 百拇医药
HP-3(79.0 g)经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 9∶1～2∶1)梯度洗脱，TLC检测合并相同组分得Frs.A～G共7个流分。Fr.B(9.8 g)经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 5∶1～4∶1)，得10个小流分(Frs.B1～10)。Frs.B3～B5中有沉淀析出，过滤沉淀后，滤液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化(甲醇)，得化合物1(228.3 mg)，2(32.1 mg)。Fr.C(1.5 g)先后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇：氯仿 3∶1)和硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 5∶1～3∶1)多次纯化得化合物9(119.6 mg)，5(3.73 mg)。Fr.E(2.3 g)和Fr.F(2.8 g)合并后，经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇 5∶1～4∶1)分离，所得主体部分再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)纯化，得化合物3(67.5 mg)，4(16.3 mg)，6(12.9 mg)。, 百拇医药(马燕春 张旻 徐文彤 冯世秀 雷鸣 易博)