亚硝胺致食管癌前病变时Wnt通路抑制因子的变化及膈下逐瘀汤的影响(1)
[收稿日期] 2013-12-08
[基金项目] 福建省自然科学基金项目(2012J01389)
[通信作者] *刘艳，Tel：13305920475，E-mail：liu_yan1976@126.com
[作者简介] 施文荣，副教授，硕士生导师，Tel：13328219556
[摘要] 目的：探讨甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱发食管癌前病变Wnt通路抑制因子的变化及膈下逐瘀汤的影响。方法：Wistar大鼠按3.5 mg·kg-1体重剂量皮下注射MBNA溶液，每周2次，造模首日起以膈下逐瘀汤16，8 g·kg-1剂量灌胃给药，于造模第10周处死各组大鼠，观察食管黏膜病理变化，荧光定量PCR检测sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β mRNA转录水平，Western blot检测β-catenin蛋白水平。结果：MBNA诱导下，模型组大鼠食管黏膜病理学检查呈轻度不典型增生，膈下逐瘀汤高、低剂量组与模型组比较病理形态学与组织学均未有明显改善；模型组大鼠食管组织sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较对照组降低(P<0.05或P<0.01)，β-catenin蛋白水平较对照组升高(P<0.01)，膈下逐瘀汤低剂量组sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较模型组升高(P<0.05或P<0.01)，β-catenin蛋白水平较模型组降低(P<0.01)。结论：上调β-catenin蛋白水平、下调Wnt通路抑制因子转录水平从而增强Wnt通路活性是MBNA致大鼠食管癌前病变的可能分子机制之一，膈下逐瘀汤虽可下调β-catenin蛋白水平、上调Wnt通路抑制因子转录水平，但不足以阻断MBNA诱发的食管癌前病变。
, 百拇医药
[关键词] 甲基苄基亚硝胺；食管癌；膈下逐瘀汤；大鼠；β-catenin；sFRP；Axin；GSK-3β
亚硝胺类化合物是常见化学致癌物之一，约有10余种亚硝胺与食管癌的发病有关，如甲基苄基亚硝胺(MBNA)、甲基戊基亚硝胺等。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、发育和分化的重要途径，与多种人类肿瘤的发生、浸润和转移密切相关[1]。已有研究证实，在人类食管癌的发生过程中也存在Wnt/β-catenin通路的激活[2-3]。
中医认为“气塞不通，血壅不流”与癌瘤的发生有关，气滞日久必血瘀不畅，气滞血瘀，渐成瘤块，久积为癌，因此理气活血类方剂如膈下逐瘀汤广泛应用于恶性肿瘤防治的中医临床实践[4-5]。为探讨亚硝胺致食管癌变与Wnt通路的关系及理气活血类方剂对该通路的影响，本研究以MBNA为诱变剂建立大鼠食管癌前病变模型，并于诱变期间予以膈下逐瘀汤干预，检测了食管组织β-catenin蛋白的表达变化及Wnt通路抑制因子sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β的基因转录水平变化，为人类食管癌的发病机制提供参数，并为食管癌的中医药防治研究提供基础资料。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物 雄性Wistar大鼠，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限公司，体重180～200 g，生产许可证号SCXK(沪)2012-0002，合格证号2007000541047。
1.2 药物与试剂 MBNA(本实验室有机合成)；RNA guard(上海华舜生物技术有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex Taq(大连宝生物工程有限公司)；兔抗β-catenin多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；兔抗GAPDH多克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG抗体、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。膈下逐瘀汤全成分颗粒剂由福建省人民医院中药房提供，处方为：醋五灵脂6 g、当归9 g、川芎6 g、桃仁9 g、牡丹皮6 g、赤芍6 g、乌药6 g、醋延胡索3 g、甘草9 g、醋香附6 g、红花9 g、炒枳壳5 g，处方编号21095649。
, 百拇医药
1.3 仪器 SDS-PAGE电泳仪、转膜仪(美国BIO-RAD公司)；荧光定量PCR仪(德国Eppendorf公司)。
2 方法
2.1 分组与给药 Wistar大鼠按体重分层随机分为模型组、膈下逐瘀汤高、低剂量组及正常对照组，每组8只。除对照组，其余各组参考文献方法[6]，以MBNA 3.5 mg·kg-1体重剂量，每周2次颈背部皮下注射，连续注射10周。对照组颈背部皮下注射等体积氯化钠注射液。于诱变首日开始，膈下逐瘀汤高、低剂量组分别以膈下逐瘀汤16，8 g·kg-1剂量(以全方生药量计)灌胃给药，模型组和对照组以等体积蒸馏水灌胃，每日1次，共10周。根据实验动物等效临床剂量换算，膈下逐瘀汤给药剂量相当于成人日剂量的2，1倍。
2.2 病理学检查 实验结束时处死大鼠，沿食管纵行剖开，于解剖镜下观察食管黏膜病变情况，拍照记录。取典型病变组织用10%中性福尔马林固定液固定，常规制片，HE染色，光镜观察病理组织学变化。余下食管组织分为2份，保存于RNA guard及液氮中，分别用于提取食管组织总RNA及总蛋白。
2.3 基因转录水平检测 sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β基因转录水平检测采用Real-time RT-PCR法。用Trizol法提取食管组织总RNA，核酸蛋白分析仪检测A260/A280，计算RNA浓度；琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用RevertAid First Strand cDNA synthesis kit试剂盒将总RNA中的mRNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行荧光实时定量PCR检测(SYBR染料法)。扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt值表示目的基因转录水平。各基因引物及扩增产物片段长度见表1。, 百拇医药(施文荣 刘艳 谢金东 卓实 涂春香 谢佐福)
[基金项目] 福建省自然科学基金项目(2012J01389)
[通信作者] *刘艳，Tel：13305920475，E-mail：liu_yan1976@126.com
[作者简介] 施文荣，副教授，硕士生导师，Tel：13328219556
[摘要] 目的：探讨甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱发食管癌前病变Wnt通路抑制因子的变化及膈下逐瘀汤的影响。方法：Wistar大鼠按3.5 mg·kg-1体重剂量皮下注射MBNA溶液，每周2次，造模首日起以膈下逐瘀汤16，8 g·kg-1剂量灌胃给药，于造模第10周处死各组大鼠，观察食管黏膜病理变化，荧光定量PCR检测sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β mRNA转录水平，Western blot检测β-catenin蛋白水平。结果：MBNA诱导下，模型组大鼠食管黏膜病理学检查呈轻度不典型增生，膈下逐瘀汤高、低剂量组与模型组比较病理形态学与组织学均未有明显改善；模型组大鼠食管组织sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较对照组降低(P<0.05或P<0.01)，β-catenin蛋白水平较对照组升高(P<0.01)，膈下逐瘀汤低剂量组sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较模型组升高(P<0.05或P<0.01)，β-catenin蛋白水平较模型组降低(P<0.01)。结论：上调β-catenin蛋白水平、下调Wnt通路抑制因子转录水平从而增强Wnt通路活性是MBNA致大鼠食管癌前病变的可能分子机制之一，膈下逐瘀汤虽可下调β-catenin蛋白水平、上调Wnt通路抑制因子转录水平，但不足以阻断MBNA诱发的食管癌前病变。
, 百拇医药
[关键词] 甲基苄基亚硝胺；食管癌；膈下逐瘀汤；大鼠；β-catenin；sFRP；Axin；GSK-3β
亚硝胺类化合物是常见化学致癌物之一，约有10余种亚硝胺与食管癌的发病有关，如甲基苄基亚硝胺(MBNA)、甲基戊基亚硝胺等。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、发育和分化的重要途径，与多种人类肿瘤的发生、浸润和转移密切相关[1]。已有研究证实，在人类食管癌的发生过程中也存在Wnt/β-catenin通路的激活[2-3]。
中医认为“气塞不通，血壅不流”与癌瘤的发生有关，气滞日久必血瘀不畅，气滞血瘀，渐成瘤块，久积为癌，因此理气活血类方剂如膈下逐瘀汤广泛应用于恶性肿瘤防治的中医临床实践[4-5]。为探讨亚硝胺致食管癌变与Wnt通路的关系及理气活血类方剂对该通路的影响，本研究以MBNA为诱变剂建立大鼠食管癌前病变模型，并于诱变期间予以膈下逐瘀汤干预，检测了食管组织β-catenin蛋白的表达变化及Wnt通路抑制因子sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β的基因转录水平变化，为人类食管癌的发病机制提供参数，并为食管癌的中医药防治研究提供基础资料。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物 雄性Wistar大鼠，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限公司，体重180～200 g，生产许可证号SCXK(沪)2012-0002，合格证号2007000541047。
1.2 药物与试剂 MBNA(本实验室有机合成)；RNA guard(上海华舜生物技术有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex Taq(大连宝生物工程有限公司)；兔抗β-catenin多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；兔抗GAPDH多克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG抗体、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。膈下逐瘀汤全成分颗粒剂由福建省人民医院中药房提供，处方为：醋五灵脂6 g、当归9 g、川芎6 g、桃仁9 g、牡丹皮6 g、赤芍6 g、乌药6 g、醋延胡索3 g、甘草9 g、醋香附6 g、红花9 g、炒枳壳5 g，处方编号21095649。
, 百拇医药
1.3 仪器 SDS-PAGE电泳仪、转膜仪(美国BIO-RAD公司)；荧光定量PCR仪(德国Eppendorf公司)。
2 方法
2.1 分组与给药 Wistar大鼠按体重分层随机分为模型组、膈下逐瘀汤高、低剂量组及正常对照组，每组8只。除对照组，其余各组参考文献方法[6]，以MBNA 3.5 mg·kg-1体重剂量，每周2次颈背部皮下注射，连续注射10周。对照组颈背部皮下注射等体积氯化钠注射液。于诱变首日开始，膈下逐瘀汤高、低剂量组分别以膈下逐瘀汤16，8 g·kg-1剂量(以全方生药量计)灌胃给药，模型组和对照组以等体积蒸馏水灌胃，每日1次，共10周。根据实验动物等效临床剂量换算，膈下逐瘀汤给药剂量相当于成人日剂量的2，1倍。
2.2 病理学检查 实验结束时处死大鼠，沿食管纵行剖开，于解剖镜下观察食管黏膜病变情况，拍照记录。取典型病变组织用10%中性福尔马林固定液固定，常规制片，HE染色，光镜观察病理组织学变化。余下食管组织分为2份，保存于RNA guard及液氮中，分别用于提取食管组织总RNA及总蛋白。
2.3 基因转录水平检测 sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β基因转录水平检测采用Real-time RT-PCR法。用Trizol法提取食管组织总RNA，核酸蛋白分析仪检测A260/A280，计算RNA浓度；琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用RevertAid First Strand cDNA synthesis kit试剂盒将总RNA中的mRNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行荧光实时定量PCR检测(SYBR染料法)。扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt值表示目的基因转录水平。各基因引物及扩增产物片段长度见表1。, 百拇医药(施文荣 刘艳 谢金东 卓实 涂春香 谢佐福)