基于“组分结构”理论的8种墨旱莲乙酸乙酯提取物对NHBE细胞保护作用的比较(1)
[收稿日期] 2013-12-13
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30973944，81274088)
[通信作者] *贾晓斌，研究员，博士生导师，Tel：(025)85637809，E-mail： xiaobinjia_nj@126.com
[作者简介] 丁淑敏，博士研究生，Tel：(025)85637809， E-mail： dsm@cczu.edu.cn
[摘要] 基于“组分结构”理论对来源不同的墨旱莲乙酸乙酯提取物(EAEEP)中活性成分进行分析比较，研究其保护正常人支气管上皮(normal human bronchial epithelial，NHBE)细胞的物质基础构成。以MTT法比较不同EAEEP对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)诱导的NHBE细胞保护作用，并采用UPLC分析不同EAEEP中酚酸、香豆草醚及黄酮类组分的含量。结果发现，8种EAEEP(0～200 mg·L-1)对NHBE细胞均有一定保护作用，并存在统计差异。其中，保护作用较强的是EAEEPⅦ和EAEEPⅧ，其EC50分别为46.97，56.29 mg·L-1。UPLC分析显示，8种EAEEP中酚酸、香豆草醚及黄酮类组分的含量存在显著差异。而作用最强的EAEEPⅦ(89.15 mg·L-1)和EAEEPⅧ(57.44 mg·L-1)质量总量却并非最高，最高的为EAEEPⅢ(132.25 mg·L-1)。结合“组分结构”理论，分析发现EAEEPⅦ和EAEEPⅧ中酚酸、香豆草醚及黄酮类组分的质量结构与其他样品显著不同，分别为1.0∶1.0∶0.5和1.0∶1.9∶0.8。提示EAEEP中可能存在特定的最优“组分结构”关系，可为其物质基础研究及质量控制提供参考。
, http://www.100md.com
[关键词] 墨旱莲；组分结构；超高效液相色谱(UPLC)；烟雾提取物
墨旱莲为菊科鳢肠属植物鳢肠Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，中医用其滋补肝肾、凉血止血等[1]。近年来药理研究发现墨旱莲中香豆草醚类和黄酮类成分具有免疫增强及抗氧化作用[2]。本实验室在研究中发现，墨旱莲提取物对香烟诱导的正常人支气管上皮(normal human bronchial epithelium，NHBE)细胞具有保护作用[3]，其乙酸乙酯总提物效果尤为显著，并从墨旱莲乙酸乙酯提取物中鉴定出酚酸类成分。大量研究表明，香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)中含有多种化学成分，其中有许多是已知的致癌物质或癌症的启动子[4-5]。NHBE细胞长期受烟雾刺激会导致细胞不规则增生及形态的改变，恶化，甚至引发肺癌。墨旱莲提取物能有效缓解香烟提取物对细胞的毒性，提高细胞存活率。因此，具有一定肺癌化学预防潜力。然而，墨旱莲提取物对香烟诱导的NHBE细胞保护作用的物质基础至今尚不明确。
, 百拇医药
中药成分十分复杂，使其药效物质基础的研究比较困难。基于中药物质基础是多成分构成的，本实验室提出，中药多种成分并不是简单的堆积，而是一个有序的整体，单体成分是其最基本的单位，相似的单体成分按照一定的比例构成了组分，不同的组分又按照一定的比例构成了中药的整体，即“中药组分结构理论”[6]。本研究即在此理论基础上，对8种墨旱莲乙酸乙酯提取物的活性进行比较，并对其中活性物质的含量及构成进行分析。初步探索墨旱莲发挥药效的量效关系及构效关系规律，为更好的开发和利用墨旱莲提供理论依据，也为中药物质基础研究提供参考方法。
1 材料
1.1 仪器
Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪，包括二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)以及Waters Empower2 软件(美国，Waters 公司)。Mettler Toledo-MT5电子天平(Mettler Toledo分析仪器有限公司)；KQ5200DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；LDZX-50K型立式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)；HE-RA CELL 500型CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)。
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1.2 药品与试剂
原儿茶酸(110809-200604)、木犀草苷(111720-200905)、木犀草素(111520-200504)、蟛蜞菊内酯(111885-201102)和芹菜素(111901-201001)均购自中国食品药品检定研究院；异去甲蟛蜞菊内酯购自上海将来实业有限公司(纯度≥99.0%)；异绿原酸A和异绿原酸C购自成都普瑞科技开发有限公司(纯度≥99.0%)；表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，≥95%)购自Sigma公司。人支气管上皮细胞NHBE(美国，ATCC)。乙腈(美国Merck公司)、甲酸、甲醇(美国Tedia Company公司)均为色谱纯。8批墨旱莲药材分别来自安徽、江苏、湖北和河南等地，经南京中医药大学生药学教研室吴德康教授鉴定为菊科植物鳢肠E. prostrata的干燥地上部分。提取物对应药材批次依次为EAEEPⅠ(江苏20120618)，EAEEPⅡ(江苏20120606)，EAEEPⅢ(安徽20120601)，EAEEPⅣ(安徽20120602)，EAEEPⅤ(湖北20120506)，EAEEPⅥ(湖北20120606)，EAEEPⅦ(河南20121101)和EAEEPⅧ(河南20121109)。灭菌胎牛血清(FBS，GIBCO)，RPMI1640 培养基(南京凯基生物科技有限公司)，四噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)。
2 方法
2.1 墨旱莲乙酸乙酯提取物的制备, 百拇医药(丁淑敏 刘丹 封亮 朱粉霞 谭晓斌 贾晓斌)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30973944，81274088)
[通信作者] *贾晓斌，研究员，博士生导师，Tel：(025)85637809，E-mail： xiaobinjia_nj@126.com
[作者简介] 丁淑敏，博士研究生，Tel：(025)85637809， E-mail： dsm@cczu.edu.cn
[摘要] 基于“组分结构”理论对来源不同的墨旱莲乙酸乙酯提取物(EAEEP)中活性成分进行分析比较，研究其保护正常人支气管上皮(normal human bronchial epithelial，NHBE)细胞的物质基础构成。以MTT法比较不同EAEEP对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)诱导的NHBE细胞保护作用，并采用UPLC分析不同EAEEP中酚酸、香豆草醚及黄酮类组分的含量。结果发现，8种EAEEP(0～200 mg·L-1)对NHBE细胞均有一定保护作用，并存在统计差异。其中，保护作用较强的是EAEEPⅦ和EAEEPⅧ，其EC50分别为46.97，56.29 mg·L-1。UPLC分析显示，8种EAEEP中酚酸、香豆草醚及黄酮类组分的含量存在显著差异。而作用最强的EAEEPⅦ(89.15 mg·L-1)和EAEEPⅧ(57.44 mg·L-1)质量总量却并非最高，最高的为EAEEPⅢ(132.25 mg·L-1)。结合“组分结构”理论，分析发现EAEEPⅦ和EAEEPⅧ中酚酸、香豆草醚及黄酮类组分的质量结构与其他样品显著不同，分别为1.0∶1.0∶0.5和1.0∶1.9∶0.8。提示EAEEP中可能存在特定的最优“组分结构”关系，可为其物质基础研究及质量控制提供参考。
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[关键词] 墨旱莲；组分结构；超高效液相色谱(UPLC)；烟雾提取物
墨旱莲为菊科鳢肠属植物鳢肠Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，中医用其滋补肝肾、凉血止血等[1]。近年来药理研究发现墨旱莲中香豆草醚类和黄酮类成分具有免疫增强及抗氧化作用[2]。本实验室在研究中发现，墨旱莲提取物对香烟诱导的正常人支气管上皮(normal human bronchial epithelium，NHBE)细胞具有保护作用[3]，其乙酸乙酯总提物效果尤为显著，并从墨旱莲乙酸乙酯提取物中鉴定出酚酸类成分。大量研究表明，香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)中含有多种化学成分，其中有许多是已知的致癌物质或癌症的启动子[4-5]。NHBE细胞长期受烟雾刺激会导致细胞不规则增生及形态的改变，恶化，甚至引发肺癌。墨旱莲提取物能有效缓解香烟提取物对细胞的毒性，提高细胞存活率。因此，具有一定肺癌化学预防潜力。然而，墨旱莲提取物对香烟诱导的NHBE细胞保护作用的物质基础至今尚不明确。
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中药成分十分复杂，使其药效物质基础的研究比较困难。基于中药物质基础是多成分构成的，本实验室提出，中药多种成分并不是简单的堆积，而是一个有序的整体，单体成分是其最基本的单位，相似的单体成分按照一定的比例构成了组分，不同的组分又按照一定的比例构成了中药的整体，即“中药组分结构理论”[6]。本研究即在此理论基础上，对8种墨旱莲乙酸乙酯提取物的活性进行比较，并对其中活性物质的含量及构成进行分析。初步探索墨旱莲发挥药效的量效关系及构效关系规律，为更好的开发和利用墨旱莲提供理论依据，也为中药物质基础研究提供参考方法。
1 材料
1.1 仪器
Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪，包括二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)以及Waters Empower2 软件(美国，Waters 公司)。Mettler Toledo-MT5电子天平(Mettler Toledo分析仪器有限公司)；KQ5200DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；LDZX-50K型立式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)；HE-RA CELL 500型CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)。
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1.2 药品与试剂
原儿茶酸(110809-200604)、木犀草苷(111720-200905)、木犀草素(111520-200504)、蟛蜞菊内酯(111885-201102)和芹菜素(111901-201001)均购自中国食品药品检定研究院；异去甲蟛蜞菊内酯购自上海将来实业有限公司(纯度≥99.0%)；异绿原酸A和异绿原酸C购自成都普瑞科技开发有限公司(纯度≥99.0%)；表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，≥95%)购自Sigma公司。人支气管上皮细胞NHBE(美国，ATCC)。乙腈(美国Merck公司)、甲酸、甲醇(美国Tedia Company公司)均为色谱纯。8批墨旱莲药材分别来自安徽、江苏、湖北和河南等地，经南京中医药大学生药学教研室吴德康教授鉴定为菊科植物鳢肠E. prostrata的干燥地上部分。提取物对应药材批次依次为EAEEPⅠ(江苏20120618)，EAEEPⅡ(江苏20120606)，EAEEPⅢ(安徽20120601)，EAEEPⅣ(安徽20120602)，EAEEPⅤ(湖北20120506)，EAEEPⅥ(湖北20120606)，EAEEPⅦ(河南20121101)和EAEEPⅧ(河南20121109)。灭菌胎牛血清(FBS，GIBCO)，RPMI1640 培养基(南京凯基生物科技有限公司)，四噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)。
2 方法
2.1 墨旱莲乙酸乙酯提取物的制备, 百拇医药(丁淑敏 刘丹 封亮 朱粉霞 谭晓斌 贾晓斌)