菠萝叶酚体外HepG2细胞跨膜转运及其对糖脂分布的影响(1)
[收稿日期] 2013-12-20
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09103-201-041)
[通信作者] *杜力军，E-mail：lijundu@mail.tsinghua.edu.cn
[摘要] 菠萝叶主要含酚类成分，具有抗氧化和调血脂作用。其主要成分为对香豆酸。该文以对香豆酸为主要测试成分，观察了菠萝叶酚类成分中对香豆酸体外人源肝HepG2细胞跨膜转运的特点及其对糖脂负荷细胞实验中葡萄糖，总胆固醇和甘油三醇的转运代谢的影响。结果表明，菠萝叶酚具有较好的跨膜转运特点。给药后5 min，菠萝叶酚中的对香豆酸即细胞内达到较高的浓度，60 min达峰值。具有时间和剂量依赖性。在促进葡萄糖转运体(GLUT4)和低密度脂蛋白受体(LDLR)表达的同时，菠萝叶酚能够降低细胞内的糖脂含量。这种降低细胞内脂含量的作用与促进脂蛋白脂酶(LPL)、肝甘油三酯脂酶(HTGL)表达有关，降低细胞内葡萄糖含量的作用与促进肝糖原合成有关。
, 百拇医药
[关键词] 菠萝叶；跨膜转运；对香豆酸；脂类；葡萄糖
菠萝在我国南方是一种大量栽培种植的水果。在生产菠萝水果的同时也产生了大量的茎叶。菠萝叶质地较厚，含大量的纤维，不易腐烂，简单地将其还田难度较大[1]。为此国家农业部投入了大量的资金来研究菠萝叶的再利用技术[2]。比如从叶中抽取粗纤维，用于纺织和缆绳[3-4]，或经过处理制作肥料[5]，或制作发酵饲料[6]。因此如何有效利用这一资源提高其使用效率是一个值得关注的问题。
《中华本草》记载菠萝叶具有消食和胃，止泻的作用，可用于夏日暑泻，消化不良，胃脘胀痛[7]。化学和药理学研究表明，菠萝叶中主要含酚类成分[8-9]，具有明确的抗氧化和调血脂作用[10-11]。且毒性较低[12]。作者的前期实验数据表明小鼠灌胃最大给药剂量为12 g·kg-1。药物吸收动力学研究表明，小鼠灌胃菠萝叶酚后5 min血中即可检测到主要活性成分对香豆酸，并达到峰值[13]。并且在小肠吸收过程中存在着菠萝叶酚其他酚类成分向对香豆酸转化的现象。这一现象的结果直接提高了体内对香豆酸的含量[14]。对于这样快的吸收和代谢以及成分之间集中转化的现象与肝细胞内糖脂转运及其代谢有何种关系，对于深入探讨其调脂作用及其确定主要活性成分具有重要的意义。为此，作者以人源肝癌HepG2细胞为载体，以其中主要成分对香豆酸为测试对象，对菠萝叶酚体外细胞跨膜转运进行了初步的实验研究。
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1 材料与方法
1.1 药物与试剂 人源肝癌HepG2细胞由中国医学科学院药用植物研究所曹丽研究员惠赠。采用含10%胎牛血清DMEM培养基常规培养。每2～3 d传代1次。菠萝叶采集于海南博鳌，经鉴定为凤梨科植物菠萝Ananas comosus L.的叶。菠萝叶酚(BLP， bolo leaf phenols)为菠萝叶中富含酚类成分的部位。从菠萝叶乙醇提取并经大孔树脂纯化而得。其中对香豆酸(p-coumaric acid)质量分数为1.14%。用时用生理盐水配制成所需浓度。对香豆酸对照品购自Sigma公司，纯度大于98%。总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，葡萄糖(glucose)试剂盒均购自北京中生生化试剂公司，试剂批号分别为20130712，20130501，20130917。
1.2 仪器 CO2培养箱(Sanyo公司，日本)；Olympus 倒置显微镜(日本)；Roche480实时定量PCR仪(德国)；Waters 996 DAD液相色谱工作站，515双泵，Empower2软件处理数据(美国)；550BIO-RAD酶标仪(美国)。
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1.3 菠萝叶酚跨膜转运 时间依赖性：分别将传代生长良好的HepG2细胞(1×106个/mL，2 mL/孔)接种于24孔板内(每组平行3孔)，24 h后换含有一定浓度BLP的培养液。BLP体外给药终浓度为100 mg·L-1。分别于15，30，60，90，120，360 min收集培养液，用磷酸缓冲液(PBS)轻洗细胞2遍，直接加入100 μL蒸馏水，冻融。收集冻融液于EP管内。离心，取上清到青霉瓶内，加入甲醇(0.5 mL/孔)对EP管内的残渣提取2遍，合并提取液于青霉素瓶内。37 ℃水浴蒸干。再用甲醇(100 μL/瓶)溶解并转移至另一新EP管中，离心取上清，进样10 μL，进行HPLC测定分析。沉淀部分用去离子水定容后用于蛋白定量。双缩脲法测蛋白含量[15]。
浓度依赖性：分别接种生长良好的HepG2细胞，24 h后换不同浓度的BLP培养液，分别于给药后30，60 min收集培养液，制备胞内样品(制备方法同上)。BLP给药终浓度分别为50，100，200 mg·L-1。
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1.4 色谱条件[13] 以0.3磷酸水(pH 3)-乙腈16∶84 为流动相，柱温为室温，流速1 mL·min-1，紫外检测波长310 nm，C18色谱柱(Waters，4.6 mm×150 mm，0.5 μm)，进样量10 μL，对香豆酸的线性方程Y=20 957X-609.29。对香豆酸在0.098～1.568 mg·L-1线性关系良好(R2=0.999 9)。最低检出量(LOD)为0.02 mg·L-1，最低定量限(LOQ)为0.098 mg·L-1。
1.5 高浓度糖脂转运 取HepG2细胞接种于24孔板内，使其密度达80%。24 h后，分别换入5%葡萄糖或50%胎牛血清的EMEM培养基造模，分别于造模后15，30，90 min收集培养液，用生理盐水洗2遍，每孔加入100 μL去离子水，-20 ℃过夜冻融。收集冻融液于EP管内，12 000 r·min-1离心10 min，取上清测葡萄糖和糖元或TC和TG。沉淀加入定量去离子水(50 μL/管)，吹打至溶解，测蛋白含量(双缩脲法)。肝糖原测试用Forlin′s法[16-17]。高脂负荷模型为50%胎牛血清DMEM造模[18]。高糖负荷模型为5%葡萄糖DMEM[19]。给药组为含BLP的高浓度糖脂培养基。通过细胞毒预实验确定BLP最大安全剂量为1 g·L-1，因此本实验中BLP终浓度定为100 mg·L-1。对照组为等体积生理盐水。, http://www.100md.com(庞雨浓 柴玉爽 姜敬非 王欣佩 余煊 雷帆 邢东明 杜力军)
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09103-201-041)
[通信作者] *杜力军，E-mail：lijundu@mail.tsinghua.edu.cn
[摘要] 菠萝叶主要含酚类成分，具有抗氧化和调血脂作用。其主要成分为对香豆酸。该文以对香豆酸为主要测试成分，观察了菠萝叶酚类成分中对香豆酸体外人源肝HepG2细胞跨膜转运的特点及其对糖脂负荷细胞实验中葡萄糖，总胆固醇和甘油三醇的转运代谢的影响。结果表明，菠萝叶酚具有较好的跨膜转运特点。给药后5 min，菠萝叶酚中的对香豆酸即细胞内达到较高的浓度，60 min达峰值。具有时间和剂量依赖性。在促进葡萄糖转运体(GLUT4)和低密度脂蛋白受体(LDLR)表达的同时，菠萝叶酚能够降低细胞内的糖脂含量。这种降低细胞内脂含量的作用与促进脂蛋白脂酶(LPL)、肝甘油三酯脂酶(HTGL)表达有关，降低细胞内葡萄糖含量的作用与促进肝糖原合成有关。
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[关键词] 菠萝叶；跨膜转运；对香豆酸；脂类；葡萄糖
菠萝在我国南方是一种大量栽培种植的水果。在生产菠萝水果的同时也产生了大量的茎叶。菠萝叶质地较厚，含大量的纤维，不易腐烂，简单地将其还田难度较大[1]。为此国家农业部投入了大量的资金来研究菠萝叶的再利用技术[2]。比如从叶中抽取粗纤维，用于纺织和缆绳[3-4]，或经过处理制作肥料[5]，或制作发酵饲料[6]。因此如何有效利用这一资源提高其使用效率是一个值得关注的问题。
《中华本草》记载菠萝叶具有消食和胃，止泻的作用，可用于夏日暑泻，消化不良，胃脘胀痛[7]。化学和药理学研究表明，菠萝叶中主要含酚类成分[8-9]，具有明确的抗氧化和调血脂作用[10-11]。且毒性较低[12]。作者的前期实验数据表明小鼠灌胃最大给药剂量为12 g·kg-1。药物吸收动力学研究表明，小鼠灌胃菠萝叶酚后5 min血中即可检测到主要活性成分对香豆酸，并达到峰值[13]。并且在小肠吸收过程中存在着菠萝叶酚其他酚类成分向对香豆酸转化的现象。这一现象的结果直接提高了体内对香豆酸的含量[14]。对于这样快的吸收和代谢以及成分之间集中转化的现象与肝细胞内糖脂转运及其代谢有何种关系，对于深入探讨其调脂作用及其确定主要活性成分具有重要的意义。为此，作者以人源肝癌HepG2细胞为载体，以其中主要成分对香豆酸为测试对象，对菠萝叶酚体外细胞跨膜转运进行了初步的实验研究。
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1 材料与方法
1.1 药物与试剂 人源肝癌HepG2细胞由中国医学科学院药用植物研究所曹丽研究员惠赠。采用含10%胎牛血清DMEM培养基常规培养。每2～3 d传代1次。菠萝叶采集于海南博鳌，经鉴定为凤梨科植物菠萝Ananas comosus L.的叶。菠萝叶酚(BLP， bolo leaf phenols)为菠萝叶中富含酚类成分的部位。从菠萝叶乙醇提取并经大孔树脂纯化而得。其中对香豆酸(p-coumaric acid)质量分数为1.14%。用时用生理盐水配制成所需浓度。对香豆酸对照品购自Sigma公司，纯度大于98%。总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，葡萄糖(glucose)试剂盒均购自北京中生生化试剂公司，试剂批号分别为20130712，20130501，20130917。
1.2 仪器 CO2培养箱(Sanyo公司，日本)；Olympus 倒置显微镜(日本)；Roche480实时定量PCR仪(德国)；Waters 996 DAD液相色谱工作站，515双泵，Empower2软件处理数据(美国)；550BIO-RAD酶标仪(美国)。
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1.3 菠萝叶酚跨膜转运 时间依赖性：分别将传代生长良好的HepG2细胞(1×106个/mL，2 mL/孔)接种于24孔板内(每组平行3孔)，24 h后换含有一定浓度BLP的培养液。BLP体外给药终浓度为100 mg·L-1。分别于15，30，60，90，120，360 min收集培养液，用磷酸缓冲液(PBS)轻洗细胞2遍，直接加入100 μL蒸馏水，冻融。收集冻融液于EP管内。离心，取上清到青霉瓶内，加入甲醇(0.5 mL/孔)对EP管内的残渣提取2遍，合并提取液于青霉素瓶内。37 ℃水浴蒸干。再用甲醇(100 μL/瓶)溶解并转移至另一新EP管中，离心取上清，进样10 μL，进行HPLC测定分析。沉淀部分用去离子水定容后用于蛋白定量。双缩脲法测蛋白含量[15]。
浓度依赖性：分别接种生长良好的HepG2细胞，24 h后换不同浓度的BLP培养液，分别于给药后30，60 min收集培养液，制备胞内样品(制备方法同上)。BLP给药终浓度分别为50，100，200 mg·L-1。
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1.4 色谱条件[13] 以0.3磷酸水(pH 3)-乙腈16∶84 为流动相，柱温为室温，流速1 mL·min-1，紫外检测波长310 nm，C18色谱柱(Waters，4.6 mm×150 mm，0.5 μm)，进样量10 μL，对香豆酸的线性方程Y=20 957X-609.29。对香豆酸在0.098～1.568 mg·L-1线性关系良好(R2=0.999 9)。最低检出量(LOD)为0.02 mg·L-1，最低定量限(LOQ)为0.098 mg·L-1。
1.5 高浓度糖脂转运 取HepG2细胞接种于24孔板内，使其密度达80%。24 h后，分别换入5%葡萄糖或50%胎牛血清的EMEM培养基造模，分别于造模后15，30，90 min收集培养液，用生理盐水洗2遍，每孔加入100 μL去离子水，-20 ℃过夜冻融。收集冻融液于EP管内，12 000 r·min-1离心10 min，取上清测葡萄糖和糖元或TC和TG。沉淀加入定量去离子水(50 μL/管)，吹打至溶解，测蛋白含量(双缩脲法)。肝糖原测试用Forlin′s法[16-17]。高脂负荷模型为50%胎牛血清DMEM造模[18]。高糖负荷模型为5%葡萄糖DMEM[19]。给药组为含BLP的高浓度糖脂培养基。通过细胞毒预实验确定BLP最大安全剂量为1 g·L-1，因此本实验中BLP终浓度定为100 mg·L-1。对照组为等体积生理盐水。, http://www.100md.com(庞雨浓 柴玉爽 姜敬非 王欣佩 余煊 雷帆 邢东明 杜力军)