侧柏炭止血作用活性部位筛选(1)
[收稿日期] 2014-03-14
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81173547)
[通信作者] *丁安伟，教授，博士生导师，E-mail：awding105@163.com
[作者简介] 刘晨，硕士研究生，E-mail：chenliumoon@163.com
[摘要] 目的：考察侧柏炭各极性部位对干酵母致血热复合出血模型大鼠的止血作用。方法：以云南白药为阳性药，对照组及模型组ig羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，阳性组、侧柏炭石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水部位组分别ig相应的治疗药物，连续给药7 d，第7天复制血热复合出血模型，以全血及血浆黏度、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)的量、红细胞压积(HCT)、血浆凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(FIB)的量、血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、ADP诱导的血小板聚集率等评价指标为导向，考查侧柏炭各极性部位的止血作用。结果：与对照组比较，模型组大鼠各切变率下全血及血浆黏度明显增加，RBC， HGB， HCT明显升高，TT，APTT显著延长，PT显著缩短，FIB的量显著增加，PLT，PCT，MPV，PDW明显增加，ADP诱导的血小板聚集率显著降低；乙酸乙酯部位可明显降低模型大鼠全血低切黏度和血浆黏度，明显缩短TT，APTT，明显降低FIB的量，明显降低PDW，显著提高ADP诱导的血小板聚集率，改善肺组织病理性出血现象。正丁醇部位可明显增加ADP诱导的血小板聚集率；水部位可明显降低血浆黏度，明显缩短TT。但正丁醇和水部位作用程度均不及乙酸乙酯部位。石油醚部位对模型大鼠各环节的作用较弱。结论：侧柏炭乙酸乙酯部位主要通过降低血浆和全血低切黏度、改善内源性凝血功能及促进血小板聚集功能发挥其止血作用，为侧柏炭止血有效部位。
, 百拇医药
[关键词] 侧柏炭；血热出血；止血；有效部位
侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis (L.) Franco的干燥枝梢和叶[1]，始载于《神农本草经》，常用于治疗出血、风湿性关节炎、感冒、咳嗽等引起的多毛症和脱发等疾病[2]。炒炭后，其寒凉之性减弱，止血功效增强，临床用于血热所致各种出血证[3]，前期研究发现侧柏炭对血热复合出血模型大鼠有较好的治疗作用[4]，本实验旨在对侧柏炭进行初步分离，在干酵母致大鼠血热出血模型上从血液流变学、凝血功能、血小板功能等方面考查侧柏炭各极性部位的止血作用，筛选出侧柏炭止血活性部位，为研究其止血活性成分及作用机制提供一定的依据。
1 材料
1.1 动物 SD大鼠，SPF级，雄性，体重180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK(浙)2008-0033。
, 百拇医药
1.2 仪器及试剂 离心机(上海安亭科学仪器厂)；血液流变仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司)；血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)；试剂盒：纤维蛋白原(FIB，批号STG20401-34)、凝血酶时间(TT，批号STG20301-35A)、凝血酶原时间(PT，批号STG20101-49)、活化部分凝血活酶时间(APTT，批号ST20201-56)、二磷酸腺苷(ADP粉剂1瓶，缓冲液10 mL/瓶)，均购自北京中勤世帝科学仪器有限公司。
1.3 药物 侧柏叶购自河南辉县，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为柏科植物侧柏P. orientalis L. Franco的干燥枝梢和叶。将侧柏叶生品按《中国药典》2010年版规定炒至表面焦褐色、内部焦黄色即得侧柏叶炭品。取炭品适量，加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，趁热过滤，残渣加10倍量水煎煮2次，每次2 h，趁热过滤，合并4次滤液并浓缩，将浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等倍萃取10次，回收各溶剂，减压干燥至恒重，临用前以0.5% CMC-Na溶液混匀并稀释至0.2 g·mL-1(按生药量计算)，即得各相应部位供试液。将经正丁醇萃取完的水部位浓缩，减压干燥至恒重，临用前以0.5% CMC-Na溶液混匀并稀释至0.2 g·mL-1(按生药量计算)，即得水部位供试液。
, 百拇医药
2 方法
2.1 分组、造模及给药 取SD大鼠70只，随机分为对照组、模型组、阳性组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水部位组，每组10只。阳性组ig给予0.025 g·mL-1云南白药的0.5% CMC-Na混悬液(0.5 g·kg-1)，石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水部位组分别ig给予相应的供试液(生药4.0 g·kg-1)，对照组和模型组分别ig给予等体积0.5% CMC-Na溶液，连续给药7 d，每天2次，给药体积均为10 mL·kg-1。第7天给药后，模型组及各给药组大鼠sc 20%干酵母混悬液，对照组sc等体积生理盐水，注射体积均为10 mL·kg-1；注射7 h后，模型组及各给药组大鼠ig给予1 mL无水乙醇，对照组ig给予等体积蒸馏水；1 h后对照组和模型组ig给予0.5% CMC-Na溶液，其余各给药组ig给予相应的药物，给药体积均为10 mL·kg-1。
2.2 血液流变学及凝血功能相关测定 末次给药40 min后，大鼠麻醉，颈总动脉取血，3.8% 枸橼酸钠(1∶9)抗凝，1 mL全血分装，测定全血高、中、低切黏度，剩余全血以3 000 r·min-1离心10 min，取血浆，测定血浆黏度，TT，APTT，PT，FIB；另取0.5 mL全血，EDTA(1∶9)抗凝，测定RBC，HGB，HCT。
2.3 血小板功能相关指标的测定 取适量全血，3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝，800 r·min-1离心10 min，取上清液，即为富血小板血浆，剩余血液3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即为贫血小板血浆，测定ADP诱导的血小板聚集率。取0.5 mL全血，EDTA(1∶9)抗凝，测定PLT，PCT，MPV，PDW。, 百拇医药(刘晨 柳佳 郑传柱 张丽 丁安伟 喻斌)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81173547)
[通信作者] *丁安伟，教授，博士生导师，E-mail：awding105@163.com
[作者简介] 刘晨，硕士研究生，E-mail：chenliumoon@163.com
[摘要] 目的：考察侧柏炭各极性部位对干酵母致血热复合出血模型大鼠的止血作用。方法：以云南白药为阳性药，对照组及模型组ig羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，阳性组、侧柏炭石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水部位组分别ig相应的治疗药物，连续给药7 d，第7天复制血热复合出血模型，以全血及血浆黏度、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)的量、红细胞压积(HCT)、血浆凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(FIB)的量、血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、ADP诱导的血小板聚集率等评价指标为导向，考查侧柏炭各极性部位的止血作用。结果：与对照组比较，模型组大鼠各切变率下全血及血浆黏度明显增加，RBC， HGB， HCT明显升高，TT，APTT显著延长，PT显著缩短，FIB的量显著增加，PLT，PCT，MPV，PDW明显增加，ADP诱导的血小板聚集率显著降低；乙酸乙酯部位可明显降低模型大鼠全血低切黏度和血浆黏度，明显缩短TT，APTT，明显降低FIB的量，明显降低PDW，显著提高ADP诱导的血小板聚集率，改善肺组织病理性出血现象。正丁醇部位可明显增加ADP诱导的血小板聚集率；水部位可明显降低血浆黏度，明显缩短TT。但正丁醇和水部位作用程度均不及乙酸乙酯部位。石油醚部位对模型大鼠各环节的作用较弱。结论：侧柏炭乙酸乙酯部位主要通过降低血浆和全血低切黏度、改善内源性凝血功能及促进血小板聚集功能发挥其止血作用，为侧柏炭止血有效部位。
, 百拇医药
[关键词] 侧柏炭；血热出血；止血；有效部位
侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis (L.) Franco的干燥枝梢和叶[1]，始载于《神农本草经》，常用于治疗出血、风湿性关节炎、感冒、咳嗽等引起的多毛症和脱发等疾病[2]。炒炭后，其寒凉之性减弱，止血功效增强，临床用于血热所致各种出血证[3]，前期研究发现侧柏炭对血热复合出血模型大鼠有较好的治疗作用[4]，本实验旨在对侧柏炭进行初步分离，在干酵母致大鼠血热出血模型上从血液流变学、凝血功能、血小板功能等方面考查侧柏炭各极性部位的止血作用，筛选出侧柏炭止血活性部位，为研究其止血活性成分及作用机制提供一定的依据。
1 材料
1.1 动物 SD大鼠，SPF级，雄性，体重180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK(浙)2008-0033。
, 百拇医药
1.2 仪器及试剂 离心机(上海安亭科学仪器厂)；血液流变仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司)；血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)；试剂盒：纤维蛋白原(FIB，批号STG20401-34)、凝血酶时间(TT，批号STG20301-35A)、凝血酶原时间(PT，批号STG20101-49)、活化部分凝血活酶时间(APTT，批号ST20201-56)、二磷酸腺苷(ADP粉剂1瓶，缓冲液10 mL/瓶)，均购自北京中勤世帝科学仪器有限公司。
1.3 药物 侧柏叶购自河南辉县，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为柏科植物侧柏P. orientalis L. Franco的干燥枝梢和叶。将侧柏叶生品按《中国药典》2010年版规定炒至表面焦褐色、内部焦黄色即得侧柏叶炭品。取炭品适量，加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，趁热过滤，残渣加10倍量水煎煮2次，每次2 h，趁热过滤，合并4次滤液并浓缩，将浓缩液依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等倍萃取10次，回收各溶剂，减压干燥至恒重，临用前以0.5% CMC-Na溶液混匀并稀释至0.2 g·mL-1(按生药量计算)，即得各相应部位供试液。将经正丁醇萃取完的水部位浓缩，减压干燥至恒重，临用前以0.5% CMC-Na溶液混匀并稀释至0.2 g·mL-1(按生药量计算)，即得水部位供试液。
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2 方法
2.1 分组、造模及给药 取SD大鼠70只，随机分为对照组、模型组、阳性组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水部位组，每组10只。阳性组ig给予0.025 g·mL-1云南白药的0.5% CMC-Na混悬液(0.5 g·kg-1)，石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水部位组分别ig给予相应的供试液(生药4.0 g·kg-1)，对照组和模型组分别ig给予等体积0.5% CMC-Na溶液，连续给药7 d，每天2次，给药体积均为10 mL·kg-1。第7天给药后，模型组及各给药组大鼠sc 20%干酵母混悬液，对照组sc等体积生理盐水，注射体积均为10 mL·kg-1；注射7 h后，模型组及各给药组大鼠ig给予1 mL无水乙醇，对照组ig给予等体积蒸馏水；1 h后对照组和模型组ig给予0.5% CMC-Na溶液，其余各给药组ig给予相应的药物，给药体积均为10 mL·kg-1。
2.2 血液流变学及凝血功能相关测定 末次给药40 min后，大鼠麻醉，颈总动脉取血，3.8% 枸橼酸钠(1∶9)抗凝，1 mL全血分装，测定全血高、中、低切黏度，剩余全血以3 000 r·min-1离心10 min，取血浆，测定血浆黏度，TT，APTT，PT，FIB；另取0.5 mL全血，EDTA(1∶9)抗凝，测定RBC，HGB，HCT。
2.3 血小板功能相关指标的测定 取适量全血，3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝，800 r·min-1离心10 min，取上清液，即为富血小板血浆，剩余血液3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即为贫血小板血浆，测定ADP诱导的血小板聚集率。取0.5 mL全血，EDTA(1∶9)抗凝，测定PLT，PCT，MPV，PDW。, 百拇医药(刘晨 柳佳 郑传柱 张丽 丁安伟 喻斌)