虎杖苷对NRK—52E细胞缺血再灌注损伤时TLR—4表达的抑制作用(2)
ΔCt=Ct，Target-Ct，GAPDHΔΔCt=ΔCt，Time 24 h-Ct，Time 24 h
2.4 Western印迹检测TLR4和NF-κB蛋白水平 收集细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂以裂解细胞。刮下细胞，置于Eppendorf管，并用破膜仪反复抽打细胞3次以剪切细胞内核酸，使蛋白充分溶出。静置于冰上20 min以沉淀蛋白，再以12 000 r·min-1， 4 ℃高速离15 min提取蛋白保存。蛋白定量按照试剂盒说明进行。蛋白上样量为20 μg， 12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用半干式电转移法，将蛋白质转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶进行封闭，洗膜后按1∶200加入一抗，4 ℃孵育过夜。再次洗膜后加入HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育1 h，洗膜后用ECL显色并曝光于X胶片，并用凝胶图像分析系统对胶片进行扫描分析和拍照。实验重复3次。
2.5 酶联免疫法(ELISA)检测IL-1β， TNF-α表达水平 提前20 min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温，除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100 μL/孔)加入相应孔中 ......
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