虎杖苷对NRK—52E细胞缺血再灌注损伤时TLR—4表达的抑制作用(1)
[收稿日期] 2014-03-14
[通信作者] *熊维建，主任医师，重庆市中医院肾脏内科，主要从事临床肾脏病学的研究，Tel： (023)67063859，E-mail：xwj950806@126.com
[摘要] 虎杖苷(polydatin，PD)是传统中药虎杖中提取的第四单体，具有利湿退黄，活血通经等功效。研究发现其对缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)肾损伤其保护作用，目前虎杖苷在急性缺血性肾损伤中的具体作用尚不完全清楚。该实验通过培养肾小管上皮细胞(NRK-52E)，观察体外缺血再灌注损伤时虎杖苷对大鼠肾小管上皮细胞TLR4受体的干预作用并进一步探讨其对TLR4信号通路的作用机制。将体外培养的NRK-52E细胞采用缺氧复氧的方法，模拟肾I/R损伤过程。在缺氧复氧6 h/24 h时，采用realtime-PCR检测TLR4基因的表达变化，Western blot检测TLR4和NF-κB蛋白水平， ELISA检测炎症因子TNF-α，IL-1β水平。虎杖苷浓度依赖性下调TLR4的mRNA和蛋白表达水平，减少TLR4下游信号分子NF-κB的蛋白表达水平以及炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平。此外，TLR4阻断剂对缺氧复氧诱导的NRK-52E细胞NF-κB及炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平有部分抑制作用，虎杖苷可增强这一抑制作用。虎杖苷对NRK-52E细胞TLR4致炎信号通路的负性调节作用，可能是通过干预TLR4表达，影响胞内信号转导途径，抑制NF-κB表达，从而减轻肾脏炎症反应。
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[关键词] 虎杖苷；缺血再灌注损伤；Toll样受体4；急性肾损伤
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床上常见的危重急症，其死亡率可高达40%～80%[1]，炎症级联反应和免疫反应是AKI发生的重要机制[2]。最新研究报道[3-4]Toll样受体4(toll like recptor 4，TLR4)作为一类重要的模式识别受体，通过激活致炎信号通路，最终使核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化，产生炎症反应，进而引发AKI。
虎杖苷(polydatin，PD)是传统中药虎杖中提取的第4种单体，又名虎杖结晶四号，白藜芦醇苷，虎杖。有学者研究发现虎杖预处理对大鼠缺血再灌注损伤有明显的保护作用[5]，进一步探究提示虎杖苷通过抑制NF-κB和p38信号分子的激活保护肾功能[6]。本研究通过肾脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤的体外模型，旨在探讨ALR对TLR4信号通路的作用机制。
, 百拇医药
1 材料
正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)(中国科学院上海细胞研究所)； DMEM和胎牛血清(美国Hyclone公司)；虎杖苷(上海科兴生物科技公司，纯度98%，批号201102)；RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒购自(日本Takara公司)；realtime-PCR试剂盒购自(日本Takara公司)；PCR引物(由上海生工设计，日本Takara公司合成)；兔抗大鼠TLR4多克隆抗体购自(美国Sigma公司)；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG-HRP(中国晶美生物公司)；TLR4阻断剂购自(美国eBioscience公司)；IL-1β，TNF-α ELISA试剂盒(美国Santa Cruz公司)。
2 方法
2.1 细胞培养及处理 NRK-52E置于含10%胎牛血清的DMEM中培养(37 ℃，5%CO2)。当细胞生长贴壁后，每隔2～3 d换培养液1次，待细胞30%融合时用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化，1∶4传代。传代至5代的NRK-52E换用无血清培养液同步后进行虎杖苷干预：用含不同浓度虎杖苷(20，40 mg·L-1)的DMEM培养(37 ℃，5%CO2)30 min后进行体外缺氧复氧(I/R)模型实验；非虎杖苷干预组继续于含10%胎牛血清的DMEM中培养30 min(37 ℃，5%CO2)。实验分组：正常对照组、I/R模型组和虎杖苷干预组(20，40 mg·L-1 2个亚组)，于缺氧复氧6 h/ 24 h收集上清液，同时收集细胞提取总蛋白和RNA。另外一组实验在细胞同步化后，预先30 min加入TLR4阻断剂(1 mg·L-1)或和虎杖苷(40 μg·L-1 )后进行体外缺氧复氧实验。实验分组： I/R模型组、虎杖苷(40 mg·L-1)干预组、TLR4阻断剂干预组和TLR4阻断剂+虎杖苷(40 mg·L-1)干预组，于缺氧复氧6 h/24 h收集上清液，同时收集细胞提取总蛋白。
, 百拇医药
2.2 体外I/R模型制备 将细胞培养瓶置于37 ℃，含有混合低氧气体(1%O2，5%CO2，94%N2)的三气培养箱内。细胞于低氧条件下培养6 h，模拟缺氧后状态，然后再放置在37 ℃，5%CO2 ，饱和湿度的CO2孵箱，于24 h后终止实验，模拟再灌注过程。对照组则继续用10%胎牛血清的DMEM培养液培养于37 ℃，5%CO2 、饱和湿度的CO2孵箱内。
2.3 Realtime-PCR检测细胞TLR4 mRNA水平 按TRIzol试剂盒说明书操作提取总RNA，用紫外分光光度计进行浓度及纯度测定，-70 ℃保存。取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA，具体按逆转录试剂盒说明操作，再取逆转录产物2 μL进行PCR循环。目的基因TLR4引物序列：上游5′-TGAAGCTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3′，下游5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，扩增片段为326 bp。内参GAPDH引物序列：上游5′-TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3′，下游5′-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3′，扩增片段为156 bp。PCR反应条件：预变性94 ℃，30 s，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，熔解曲线 72～94 ℃，共35个循环。重复3次独立的PCR全过程。选择GAPDH作为内标，对目的基因进行均一化。目的基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法，将再灌注后24 h对照组标本(Time 24 h)内目的基因表达水平设为1，对实验组标本(Time 24 h)内目的基因表达水平进行标准化。, 百拇医药(黎颖 熊维建 杨敬 钟锦 郑劲 张玲 欧阳晓琴)
[通信作者] *熊维建，主任医师，重庆市中医院肾脏内科，主要从事临床肾脏病学的研究，Tel： (023)67063859，E-mail：xwj950806@126.com
[摘要] 虎杖苷(polydatin，PD)是传统中药虎杖中提取的第四单体，具有利湿退黄，活血通经等功效。研究发现其对缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)肾损伤其保护作用，目前虎杖苷在急性缺血性肾损伤中的具体作用尚不完全清楚。该实验通过培养肾小管上皮细胞(NRK-52E)，观察体外缺血再灌注损伤时虎杖苷对大鼠肾小管上皮细胞TLR4受体的干预作用并进一步探讨其对TLR4信号通路的作用机制。将体外培养的NRK-52E细胞采用缺氧复氧的方法，模拟肾I/R损伤过程。在缺氧复氧6 h/24 h时，采用realtime-PCR检测TLR4基因的表达变化，Western blot检测TLR4和NF-κB蛋白水平， ELISA检测炎症因子TNF-α，IL-1β水平。虎杖苷浓度依赖性下调TLR4的mRNA和蛋白表达水平，减少TLR4下游信号分子NF-κB的蛋白表达水平以及炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平。此外，TLR4阻断剂对缺氧复氧诱导的NRK-52E细胞NF-κB及炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平有部分抑制作用，虎杖苷可增强这一抑制作用。虎杖苷对NRK-52E细胞TLR4致炎信号通路的负性调节作用，可能是通过干预TLR4表达，影响胞内信号转导途径，抑制NF-κB表达，从而减轻肾脏炎症反应。
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[关键词] 虎杖苷；缺血再灌注损伤；Toll样受体4；急性肾损伤
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床上常见的危重急症，其死亡率可高达40%～80%[1]，炎症级联反应和免疫反应是AKI发生的重要机制[2]。最新研究报道[3-4]Toll样受体4(toll like recptor 4，TLR4)作为一类重要的模式识别受体，通过激活致炎信号通路，最终使核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化，产生炎症反应，进而引发AKI。
虎杖苷(polydatin，PD)是传统中药虎杖中提取的第4种单体，又名虎杖结晶四号，白藜芦醇苷，虎杖。有学者研究发现虎杖预处理对大鼠缺血再灌注损伤有明显的保护作用[5]，进一步探究提示虎杖苷通过抑制NF-κB和p38信号分子的激活保护肾功能[6]。本研究通过肾脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤的体外模型，旨在探讨ALR对TLR4信号通路的作用机制。
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1 材料
正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)(中国科学院上海细胞研究所)； DMEM和胎牛血清(美国Hyclone公司)；虎杖苷(上海科兴生物科技公司，纯度98%，批号201102)；RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒购自(日本Takara公司)；realtime-PCR试剂盒购自(日本Takara公司)；PCR引物(由上海生工设计，日本Takara公司合成)；兔抗大鼠TLR4多克隆抗体购自(美国Sigma公司)；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG-HRP(中国晶美生物公司)；TLR4阻断剂购自(美国eBioscience公司)；IL-1β，TNF-α ELISA试剂盒(美国Santa Cruz公司)。
2 方法
2.1 细胞培养及处理 NRK-52E置于含10%胎牛血清的DMEM中培养(37 ℃，5%CO2)。当细胞生长贴壁后，每隔2～3 d换培养液1次，待细胞30%融合时用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化，1∶4传代。传代至5代的NRK-52E换用无血清培养液同步后进行虎杖苷干预：用含不同浓度虎杖苷(20，40 mg·L-1)的DMEM培养(37 ℃，5%CO2)30 min后进行体外缺氧复氧(I/R)模型实验；非虎杖苷干预组继续于含10%胎牛血清的DMEM中培养30 min(37 ℃，5%CO2)。实验分组：正常对照组、I/R模型组和虎杖苷干预组(20，40 mg·L-1 2个亚组)，于缺氧复氧6 h/ 24 h收集上清液，同时收集细胞提取总蛋白和RNA。另外一组实验在细胞同步化后，预先30 min加入TLR4阻断剂(1 mg·L-1)或和虎杖苷(40 μg·L-1 )后进行体外缺氧复氧实验。实验分组： I/R模型组、虎杖苷(40 mg·L-1)干预组、TLR4阻断剂干预组和TLR4阻断剂+虎杖苷(40 mg·L-1)干预组，于缺氧复氧6 h/24 h收集上清液，同时收集细胞提取总蛋白。
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2.2 体外I/R模型制备 将细胞培养瓶置于37 ℃，含有混合低氧气体(1%O2，5%CO2，94%N2)的三气培养箱内。细胞于低氧条件下培养6 h，模拟缺氧后状态，然后再放置在37 ℃，5%CO2 ，饱和湿度的CO2孵箱，于24 h后终止实验，模拟再灌注过程。对照组则继续用10%胎牛血清的DMEM培养液培养于37 ℃，5%CO2 、饱和湿度的CO2孵箱内。
2.3 Realtime-PCR检测细胞TLR4 mRNA水平 按TRIzol试剂盒说明书操作提取总RNA，用紫外分光光度计进行浓度及纯度测定，-70 ℃保存。取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA，具体按逆转录试剂盒说明操作，再取逆转录产物2 μL进行PCR循环。目的基因TLR4引物序列：上游5′-TGAAGCTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3′，下游5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，扩增片段为326 bp。内参GAPDH引物序列：上游5′-TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3′，下游5′-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3′，扩增片段为156 bp。PCR反应条件：预变性94 ℃，30 s，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，熔解曲线 72～94 ℃，共35个循环。重复3次独立的PCR全过程。选择GAPDH作为内标，对目的基因进行均一化。目的基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法，将再灌注后24 h对照组标本(Time 24 h)内目的基因表达水平设为1，对实验组标本(Time 24 h)内目的基因表达水平进行标准化。, 百拇医药(黎颖 熊维建 杨敬 钟锦 郑劲 张玲 欧阳晓琴)