丹参调节肾组织AQP2效应与其“活血利尿”关系(1)
[收稿日期] 2014-03-24
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81072742)
[通信作者] *李锋，教授，主任医师，博士生导师，研究方向为中医药防治肾病效应机制与临床评价暨“瘀水病证”研究及其方药应用，Tel：(029)89661597，E-mail：lifeng@fmmu.edu.cn
[作者简介] 董晓静，住院医师，E-mail：dongxiaojing1210@163.com
[摘要] 通过丹参对外伤血瘀模型大鼠肾组织AQP2的调节效应，初步阐明丹参“活血利尿”的部分本质，为其临床调配用药提供指导。该文将30只SD大鼠随机分为正常组10只、血瘀证组20只，采用“定量化打击法”制备外伤血瘀证模型，再将造模动物随机分为模型组、丹参组各10只。治疗7 d后，免疫组化法、Western blot法检测大鼠肾组织AQP2蛋白表达、对比尿液AQP2含量，观察损伤局部肌肉、肾组织病理改变。结果，模型大鼠损伤局部肌肉炎性细胞浸润、血瘀并水肿，肾组织亦见瘀血肿胀且AQP2表达上调、尿AQP2含量增高，尿量减少，与正常组比较差异显著(P<0.05)；而丹参组肾组织AQP2表达下调、尿AQP2含量减低，尿量增加，与模型组比较显著降低(P<0.05)，肾组织肿胀明显减轻。表明丹参降低血瘀证大鼠尿液AQP2含量，下调肾组织AQP2蛋白表达，从而使肾小管对原尿中水的重吸收减少而增加尿量，丹参“活血”体现损伤局部组织消肿、也体现于肾脏的“利尿”，减轻瘀肿。这一疗效与丹参调节肾脏AQP2效应密切相关。验证了丹参“活血利尿”效应的部分本质。
, 百拇医药
[关键词] 血瘀证；活血利水/活血利尿；丹参；AQP2
张仲景提出的“血不利则为水”理论，不仅明确了“血与水”的生理与病理关系，亦为“活血利水”法创建及其临证应用提供了理论依据。“活血利水”法已广泛应用于临床多种疾病(心力衰竭、肾功能衰竭、肝硬化、脑水肿、卵巢囊肿、胸水、腹水、血管神经性水肿)治疗，尤以肾病、肝病、糖尿病等属中医“瘀水病证”的临证辨治；依据利水效位不同，推测“活血利水”法可分为“活血消肿、活血利尿”2类。尿液浓缩稀释功能由肾脏集合管主细胞的水通道蛋白2(aquaporin-2，AQP2)来完成，在内髓中段AQP2的含量约为12 nmol·L-1，约3%左右的AQP2随尿液排出体外，在不同的生理或病理情况下，尿AQP2的排出量不同。基于此，笔者借助AQP2表达证据，揭示丹参对血瘀证大鼠肾组织AQP2的调节效应，诠释“活血利尿”法部分本质，为“活血利尿”法调配用药提供临床指导。
1 材料
, http://www.100md.com
1.1 动物 雄性SD大鼠30只，体重(180±30) g，第四军医大学实验动物中心提供。
1.2 药物与试剂 丹参购于陕西商洛天力士丹参种植GAP基地，由西北大学生命科学院植物系房敏峰教授进行丹参药材品种鉴定，参照2010年版《中国药典》提取丹参干燥成粉，给药前以生理盐水调成混悬液，丹参生药含量为1 g·mL-1；AQP2兔抗多克隆抗体(ab95081，美国Abcam)。
2 方法
2.1 外伤血瘀模型制备 将30只SD大鼠随机分为正常组10只，血瘀证造模组20只，采用“定量化打击法”[2]，即将大鼠右后肢平放于击伤器底座平台，用500 g砝码，自58 cm高度自由落下，打击在右后肢后内侧中上部(势能大约为2.86 J，打击面积约19.2 cm2)。大鼠击后单侧跛行且无皮肤破损及出血、无骨折，即形成外伤血瘀证模型；再将造模组动物随机分为模型组、丹参组各10只。造模成功后当日，正常组、模型组以生理盐水10 μL·g-1灌胃，1次/d；丹参组按1 g·kg-1配制等体积丹参制剂混悬液灌胃，1次/d，共7 d。
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2.2 观察项目及方法 第7天给药后2 h，3%戊巴比妥钠以30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，取局部肌肉、肾组织，部分标本迅速放入4%多聚甲醛中固定，进行病理学观察及免疫组化染色；行肾组织匀浆Western Blot法测AQP2蛋白表达，应用Image-Pro Plus图像分析软件测定电泳条带平均灰度值，以β-actin为内参照。
2.3 数据处理 应用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，数据以±s表示。
3 结果
3.1 大体观察 模型组大鼠精神萎靡不振、跛行；24 h后右后肢肿胀、皮肤紫红色、蜷缩少动，食量明显减少，尿量增加、尿液AQP2浓度升高。丹参组大鼠肢体肿胀明显减轻，尿量较正常组、模型组增加，但尿液AQP2浓度减低(表1)。
3.2 病理观察 正常组肌纤维结构清晰；肾小球结构正常，肾小管上皮细胞排列整齐。模型组损伤局部肌纤维索损伤，周围见大量炎性细胞浸润，小血管瘀血；肾小球囊腔不同程度扩张、上皮细胞增生，毛细血管内皮细胞肿胀，肾小管扩张、上皮细胞肿胀、变性，毛细血管充血。丹参组肌纤维结构接近正常组；肾小管-间质病变有改善，少数间质毛细血管轻度充血(图1，2)。
, 百拇医药
3.3 肾组织AQP2表达 AQP2蛋白免疫组化表达：肾组织远端小管、集合管AQP2表达阳性，肾小球和肾间质未见表达；模型组较正常组AQP2表达加深而浓厚(P<0.05)；丹参组较模型组AQP2表达明显减少(P<0.05)(图3，表2)。
3 讨论
《重订通俗伤寒论》载“惟蓄血，由外邪搏击”，外伤致瘀肿病变与现代医学挤压综合征(crush syndrome，CS)临床症状相似，CS表现为受伤肢体局部肌肉组织血液供应断绝，毛细血管破裂并阻塞，血管通透性增加、血浆渗出，肌细胞破坏之蛋白等有害物迅速入血，造成肾小管阻塞并出现肾间质损害，导致急性肾损伤；这一损伤病变与中医“血瘀证”临证有类似之处，不仅作为血瘀证“动物模型”[1]供研究使用，而且客观体现了“血不利则为水”的中医“瘀水关联”病理。, 百拇医药(董晓静 郭亮锋 姚锐 薛松妍 李锋)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81072742)
[通信作者] *李锋，教授，主任医师，博士生导师，研究方向为中医药防治肾病效应机制与临床评价暨“瘀水病证”研究及其方药应用，Tel：(029)89661597，E-mail：lifeng@fmmu.edu.cn
[作者简介] 董晓静，住院医师，E-mail：dongxiaojing1210@163.com
[摘要] 通过丹参对外伤血瘀模型大鼠肾组织AQP2的调节效应，初步阐明丹参“活血利尿”的部分本质，为其临床调配用药提供指导。该文将30只SD大鼠随机分为正常组10只、血瘀证组20只，采用“定量化打击法”制备外伤血瘀证模型，再将造模动物随机分为模型组、丹参组各10只。治疗7 d后，免疫组化法、Western blot法检测大鼠肾组织AQP2蛋白表达、对比尿液AQP2含量，观察损伤局部肌肉、肾组织病理改变。结果，模型大鼠损伤局部肌肉炎性细胞浸润、血瘀并水肿，肾组织亦见瘀血肿胀且AQP2表达上调、尿AQP2含量增高，尿量减少，与正常组比较差异显著(P<0.05)；而丹参组肾组织AQP2表达下调、尿AQP2含量减低，尿量增加，与模型组比较显著降低(P<0.05)，肾组织肿胀明显减轻。表明丹参降低血瘀证大鼠尿液AQP2含量，下调肾组织AQP2蛋白表达，从而使肾小管对原尿中水的重吸收减少而增加尿量，丹参“活血”体现损伤局部组织消肿、也体现于肾脏的“利尿”，减轻瘀肿。这一疗效与丹参调节肾脏AQP2效应密切相关。验证了丹参“活血利尿”效应的部分本质。
, 百拇医药
[关键词] 血瘀证；活血利水/活血利尿；丹参；AQP2
张仲景提出的“血不利则为水”理论，不仅明确了“血与水”的生理与病理关系，亦为“活血利水”法创建及其临证应用提供了理论依据。“活血利水”法已广泛应用于临床多种疾病(心力衰竭、肾功能衰竭、肝硬化、脑水肿、卵巢囊肿、胸水、腹水、血管神经性水肿)治疗，尤以肾病、肝病、糖尿病等属中医“瘀水病证”的临证辨治；依据利水效位不同，推测“活血利水”法可分为“活血消肿、活血利尿”2类。尿液浓缩稀释功能由肾脏集合管主细胞的水通道蛋白2(aquaporin-2，AQP2)来完成，在内髓中段AQP2的含量约为12 nmol·L-1，约3%左右的AQP2随尿液排出体外，在不同的生理或病理情况下，尿AQP2的排出量不同。基于此，笔者借助AQP2表达证据，揭示丹参对血瘀证大鼠肾组织AQP2的调节效应，诠释“活血利尿”法部分本质，为“活血利尿”法调配用药提供临床指导。
1 材料
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1.1 动物 雄性SD大鼠30只，体重(180±30) g，第四军医大学实验动物中心提供。
1.2 药物与试剂 丹参购于陕西商洛天力士丹参种植GAP基地，由西北大学生命科学院植物系房敏峰教授进行丹参药材品种鉴定，参照2010年版《中国药典》提取丹参干燥成粉，给药前以生理盐水调成混悬液，丹参生药含量为1 g·mL-1；AQP2兔抗多克隆抗体(ab95081，美国Abcam)。
2 方法
2.1 外伤血瘀模型制备 将30只SD大鼠随机分为正常组10只，血瘀证造模组20只，采用“定量化打击法”[2]，即将大鼠右后肢平放于击伤器底座平台，用500 g砝码，自58 cm高度自由落下，打击在右后肢后内侧中上部(势能大约为2.86 J，打击面积约19.2 cm2)。大鼠击后单侧跛行且无皮肤破损及出血、无骨折，即形成外伤血瘀证模型；再将造模组动物随机分为模型组、丹参组各10只。造模成功后当日，正常组、模型组以生理盐水10 μL·g-1灌胃，1次/d；丹参组按1 g·kg-1配制等体积丹参制剂混悬液灌胃，1次/d，共7 d。
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2.2 观察项目及方法 第7天给药后2 h，3%戊巴比妥钠以30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，取局部肌肉、肾组织，部分标本迅速放入4%多聚甲醛中固定，进行病理学观察及免疫组化染色；行肾组织匀浆Western Blot法测AQP2蛋白表达，应用Image-Pro Plus图像分析软件测定电泳条带平均灰度值，以β-actin为内参照。
2.3 数据处理 应用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，数据以±s表示。
3 结果
3.1 大体观察 模型组大鼠精神萎靡不振、跛行；24 h后右后肢肿胀、皮肤紫红色、蜷缩少动，食量明显减少，尿量增加、尿液AQP2浓度升高。丹参组大鼠肢体肿胀明显减轻，尿量较正常组、模型组增加，但尿液AQP2浓度减低(表1)。
3.2 病理观察 正常组肌纤维结构清晰；肾小球结构正常，肾小管上皮细胞排列整齐。模型组损伤局部肌纤维索损伤，周围见大量炎性细胞浸润，小血管瘀血；肾小球囊腔不同程度扩张、上皮细胞增生，毛细血管内皮细胞肿胀，肾小管扩张、上皮细胞肿胀、变性，毛细血管充血。丹参组肌纤维结构接近正常组；肾小管-间质病变有改善，少数间质毛细血管轻度充血(图1，2)。
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3.3 肾组织AQP2表达 AQP2蛋白免疫组化表达：肾组织远端小管、集合管AQP2表达阳性，肾小球和肾间质未见表达；模型组较正常组AQP2表达加深而浓厚(P<0.05)；丹参组较模型组AQP2表达明显减少(P<0.05)(图3，表2)。
3 讨论
《重订通俗伤寒论》载“惟蓄血，由外邪搏击”，外伤致瘀肿病变与现代医学挤压综合征(crush syndrome，CS)临床症状相似，CS表现为受伤肢体局部肌肉组织血液供应断绝，毛细血管破裂并阻塞，血管通透性增加、血浆渗出，肌细胞破坏之蛋白等有害物迅速入血，造成肾小管阻塞并出现肾间质损害，导致急性肾损伤；这一损伤病变与中医“血瘀证”临证有类似之处，不仅作为血瘀证“动物模型”[1]供研究使用，而且客观体现了“血不利则为水”的中医“瘀水关联”病理。, 百拇医药(董晓静 郭亮锋 姚锐 薛松妍 李锋)