基于MI—RI大鼠心肌细胞代谢组学研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制(1)
[收稿日期] 2014-02-14
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81373987)；四川省2011协同创新中心“青藏高原生态畜牧业协同创新中心”项目
[通信作者] *任波，讲师，博士生研究生，研究方向为物质基础和质量标准研究，Tel：(028)61800231，E-mail： bobofuly @163.com
[作者简介] 李莹，讲师，博士，E-mail： liyiyidz @163.com
[摘要] 四逆汤是经典《伤寒论》中的急救方，由附子、甘草(炙)、干姜组成，研究建立体外H9c2心肌细胞MI-RI模型，通过观察正常对照组、MI-RI模型组、四逆汤作用组和缺甘草四逆汤作用组细胞的形态学特征，测定各组细胞的存活率、LGH和CK活性。同时收集各组细胞培养液并采用GC-MS 技术进行检测，对采集数据进行多元统计分析(PCA，PLS-DA，OPLS-DA)，得到17个代谢标志物(指认15个)，并对其相对含量及代谢途径进行分析。研究结果显示四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中氮的代谢等生物代谢途径得以实现的。研究也证明四逆汤与缺甘草四逆汤对MI-RI模型损伤H9c2心肌细胞均具有明显的保护作用，且四逆汤组保护作用更加显著。
, 百拇医药
[关键词] 四逆汤；代谢组学；H9c2 心肌细胞；MI-RI；附子配伍甘草；解毒增效
四逆汤由附子、甘草(炙)、干姜组成[1]，用于治疗心肌梗死、心力衰竭等诸多急症[2]。现代临床实践和药理学研究表明，四逆汤对心肌缺血-再灌注损伤(MI-RI)的心肌细胞具有明显的保护作用，可以影响其代谢、形态及功能等[2-4]。四逆汤中君药附子具回阳救逆之功，但燥热峻猛毒烈，配伍甘草，以“制其偏性，解毒存性”[5]。目前对附子配伍甘草解毒增效机制进行了大量而有价值的研究[6-7]，但从生物体对四逆汤复方多成分之整体反应的角度阐释该机制的研究尚薄弱。本实验采用H9c2 心肌细胞，建立体外MI-RI 模型，研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制，并采用GC-MS 联用技术对细胞培养液进行代谢组学研究，进而从代谢组学角度探讨四逆汤中附子配伍甘草的解毒增效机制。
1 材料
, 百拇医药
1.1 仪器
气相色谱-质谱联用仪(7890A GC-5975 MSD，Agilent)、CO2培养箱(Thermo Electron Corporation)；立式高压蒸汽高压灭菌器(MLS-3020，SANYO)；双人双面超净工作台(SW-CJ-2F)；通用离心机(Heraeus Megafuge 1.0R，Thermo)；酶标仪(PC plus 384)；透射电镜(H-600 IV Hitachi)；倒置显微镜(CK40，OLYMPUS)；氮气吹干仪(BF 2000- 15A)；微型旋涡混合器(WH-3)。
1.2 试药
DMEM 高糖培养基，0.25%胰蛋白酶溶液(HyClone)；胎牛血清FBS(兰州民海生物工程有限公司)；DMSO(成都科龙化工试剂厂)；MTT(Solarbio公司)；磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；链霉素(大连美罗制药厂)；青霉素(华北制药厂)；LDH，CK试剂盒(南京建成生物工程研究所)；乳酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、棕榈酸、硬脂酸(上海安研商贸有限公司)；乙腈、甲醇(Fisher Chemicals 公司)；甲氧胺盐酸盐、MSTFA、正庚烷、TMCS、吡啶(Sigma-Aldrich 公司)，实验用水均为超纯水(Milli-Q级)，其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 四逆汤和缺甘草四逆汤样品的制备[8-9]
四逆汤样品：取生附片30 g、炙甘草30 g和干姜20 g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水浸泡0.5 h，回流提取，武火煮沸后文火保持微沸1.5 h，提取液趁热用纱布滤过；提取3 次，合并水提液，减压浓缩至适量，加去离子水定容至100 mL。
缺甘草四逆汤样品：取生附片48 g和干姜32 g，其他操作同上，即得缺甘草四逆汤样品溶液100 mL。
2.2 硫代硫酸钠“缺血”液的配置
取化学缺氧剂Na2S2O3溶于PBS 中，按试验中要求配制成各浓度“缺血”液，混匀，经0.22 μm滤器滤过，避光，临用现配。
, http://www.100md.com
2.3 含药血清及细胞培养基的制备
SD大鼠，清洁级，体重(200± 20) g，雌雄各半，实验动物生产许可证编号SCXK(川)2008-24，试验前12 h禁食不禁水。随机分为3 组(正常组、四逆汤组、缺甘草四逆汤组)，每组8 只。
四逆汤组：灌胃四逆汤(预先温热)，给药量为20 μL·g-1体重，每天1次，连续7 d。缺甘草四逆汤：灌胃缺甘草四逆汤(预先温热)，其他同四逆汤组。正常组：于第7 天灌胃等量的生理盐水。末次给药后0.5 h，眼眶后静脉丛取血，静置1 h，离心(4 500 r ·min-1，10 min)，分离血清，-70 ℃冷冻保存。
取含药血清和空白血清，室温解冻，56 ℃水浴灭活30 min，用DMEM 配制细胞培养液(含血清10%)，经0.22 μm滤器滤过，除菌，临用现配。
2.4 细胞培养
H9c2大鼠心肌细胞株 (ATCC，CRL-1446，武汉博士德生物技术公司) 于含10%FBS的DMEM完全培养基(含青霉素100 U·mL-1、链霉素100 U·mL-1)中培养(培养箱条件为37 ℃，5%CO2)。贴壁生长后，2～3 d传代1次，按 1∶4传代。状态良好的取对数生长期细胞进行试验。, 百拇医药(李莹 傅超美 任波 刘圆 高飞 杨欢 彭伟 甘彦雄)
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81373987)；四川省2011协同创新中心“青藏高原生态畜牧业协同创新中心”项目
[通信作者] *任波，讲师，博士生研究生，研究方向为物质基础和质量标准研究，Tel：(028)61800231，E-mail： bobofuly @163.com
[作者简介] 李莹，讲师，博士，E-mail： liyiyidz @163.com
[摘要] 四逆汤是经典《伤寒论》中的急救方，由附子、甘草(炙)、干姜组成，研究建立体外H9c2心肌细胞MI-RI模型，通过观察正常对照组、MI-RI模型组、四逆汤作用组和缺甘草四逆汤作用组细胞的形态学特征，测定各组细胞的存活率、LGH和CK活性。同时收集各组细胞培养液并采用GC-MS 技术进行检测，对采集数据进行多元统计分析(PCA，PLS-DA，OPLS-DA)，得到17个代谢标志物(指认15个)，并对其相对含量及代谢途径进行分析。研究结果显示四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中氮的代谢等生物代谢途径得以实现的。研究也证明四逆汤与缺甘草四逆汤对MI-RI模型损伤H9c2心肌细胞均具有明显的保护作用，且四逆汤组保护作用更加显著。
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[关键词] 四逆汤；代谢组学；H9c2 心肌细胞；MI-RI；附子配伍甘草；解毒增效
四逆汤由附子、甘草(炙)、干姜组成[1]，用于治疗心肌梗死、心力衰竭等诸多急症[2]。现代临床实践和药理学研究表明，四逆汤对心肌缺血-再灌注损伤(MI-RI)的心肌细胞具有明显的保护作用，可以影响其代谢、形态及功能等[2-4]。四逆汤中君药附子具回阳救逆之功，但燥热峻猛毒烈，配伍甘草，以“制其偏性，解毒存性”[5]。目前对附子配伍甘草解毒增效机制进行了大量而有价值的研究[6-7]，但从生物体对四逆汤复方多成分之整体反应的角度阐释该机制的研究尚薄弱。本实验采用H9c2 心肌细胞，建立体外MI-RI 模型，研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制，并采用GC-MS 联用技术对细胞培养液进行代谢组学研究，进而从代谢组学角度探讨四逆汤中附子配伍甘草的解毒增效机制。
1 材料
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1.1 仪器
气相色谱-质谱联用仪(7890A GC-5975 MSD，Agilent)、CO2培养箱(Thermo Electron Corporation)；立式高压蒸汽高压灭菌器(MLS-3020，SANYO)；双人双面超净工作台(SW-CJ-2F)；通用离心机(Heraeus Megafuge 1.0R，Thermo)；酶标仪(PC plus 384)；透射电镜(H-600 IV Hitachi)；倒置显微镜(CK40，OLYMPUS)；氮气吹干仪(BF 2000- 15A)；微型旋涡混合器(WH-3)。
1.2 试药
DMEM 高糖培养基，0.25%胰蛋白酶溶液(HyClone)；胎牛血清FBS(兰州民海生物工程有限公司)；DMSO(成都科龙化工试剂厂)；MTT(Solarbio公司)；磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；链霉素(大连美罗制药厂)；青霉素(华北制药厂)；LDH，CK试剂盒(南京建成生物工程研究所)；乳酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、棕榈酸、硬脂酸(上海安研商贸有限公司)；乙腈、甲醇(Fisher Chemicals 公司)；甲氧胺盐酸盐、MSTFA、正庚烷、TMCS、吡啶(Sigma-Aldrich 公司)，实验用水均为超纯水(Milli-Q级)，其余试剂均为分析纯。
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2 方法与结果
2.1 四逆汤和缺甘草四逆汤样品的制备[8-9]
四逆汤样品：取生附片30 g、炙甘草30 g和干姜20 g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水浸泡0.5 h，回流提取，武火煮沸后文火保持微沸1.5 h，提取液趁热用纱布滤过；提取3 次，合并水提液，减压浓缩至适量，加去离子水定容至100 mL。
缺甘草四逆汤样品：取生附片48 g和干姜32 g，其他操作同上，即得缺甘草四逆汤样品溶液100 mL。
2.2 硫代硫酸钠“缺血”液的配置
取化学缺氧剂Na2S2O3溶于PBS 中，按试验中要求配制成各浓度“缺血”液，混匀，经0.22 μm滤器滤过，避光，临用现配。
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2.3 含药血清及细胞培养基的制备
SD大鼠，清洁级，体重(200± 20) g，雌雄各半，实验动物生产许可证编号SCXK(川)2008-24，试验前12 h禁食不禁水。随机分为3 组(正常组、四逆汤组、缺甘草四逆汤组)，每组8 只。
四逆汤组：灌胃四逆汤(预先温热)，给药量为20 μL·g-1体重，每天1次，连续7 d。缺甘草四逆汤：灌胃缺甘草四逆汤(预先温热)，其他同四逆汤组。正常组：于第7 天灌胃等量的生理盐水。末次给药后0.5 h，眼眶后静脉丛取血，静置1 h，离心(4 500 r ·min-1，10 min)，分离血清，-70 ℃冷冻保存。
取含药血清和空白血清，室温解冻，56 ℃水浴灭活30 min，用DMEM 配制细胞培养液(含血清10%)，经0.22 μm滤器滤过，除菌，临用现配。
2.4 细胞培养
H9c2大鼠心肌细胞株 (ATCC，CRL-1446，武汉博士德生物技术公司) 于含10%FBS的DMEM完全培养基(含青霉素100 U·mL-1、链霉素100 U·mL-1)中培养(培养箱条件为37 ℃，5%CO2)。贴壁生长后，2～3 d传代1次，按 1∶4传代。状态良好的取对数生长期细胞进行试验。, 百拇医药(李莹 傅超美 任波 刘圆 高飞 杨欢 彭伟 甘彦雄)