以抗氧化活性为指标对栀子缓释片体外释放的评价研究(1)
[摘要]以栀子提取物缓释片为模型药物，栀子苷为成分指标，DPPH自由基清除率为抗氧化活性指标，对以药效指标评价中药缓释制剂的可行性进行探讨研究。通过建立可计量的体外DPPH测定方法，以该方法测定栀子缓释片不同时间点体外释放液的抗氧化活性，绘制时间-效应曲线，采用线性回归和f2相似因子法与栀子苷的时间-累积释放度曲线比较，结果显示体外释放度评价中DPPH药效指标与栀子苷成分指标有较好相关性，提示DPPH清除率药效指标可以用来评价以环烯醚萜类为主要成分的栀子缓释片的体外释放行为。
[关键词]栀子； 缓释； DPPH自由基； 药效指标
建立能够真实、客观评价中药缓释制剂的评价体系存在较大困难，这已成为中药现代化进程的绊脚石。因为中药成分复杂，性质多样，使得中药缓控释制剂难以模仿化药的评价模式而对个别已知成分的释放行为进行评价。因此，如何立足中药作用的整体性来选择中药缓控释制剂释放性能的指标，已成为当前的研究热点，对此有学者提出计量生物效应评价法[1]。
, 百拇医药
计量生物效应评价法尝试避开中药药效物质不明、量化研究不系统的不足，选择一种新思路建立评价体系[2]。本实验选择栀子提取物亲水凝胶骨架缓释片作为模型药制剂，以DPPH自由基清除率为抗氧化活性指标，探讨提取物与DPPH清除率的量效关系，并将所建方法应用在栀子提取物缓释片的体外释放评价上，同时以栀子苷为成分指标，考察成分指标与药效指标的相关性，为以环烯醚萜类为主要成分的栀子缓释片体外释放的评价研究提供新思路。
1 材料
Prominence LC-20A型高效液相色谱仪(四元泵，SIL-20A自动进样器，CTO-10AS柱温箱，SPD-20A US-VIS检测器，岛津工作站；日本岛津)；KQ5200DA型数据超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Multiskan GO全波长酶标仪(美国thermo fisher scientific)；96孔酶标板(Corning公司)。
, 百拇医药
栀子提取物(实验室自制，批号140221)；DPPH(日本东京化成工业株式会社，批号 08110127)；羟丙基甲基纤维素(上海卡乐康包衣技术有限公司提供，批号IF10824)；微晶纤维素(北京凤礼精求商贸有限责任公司，批号20130805)；栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110749-201115)。
2 方法与结果
2.1 栀子苷的含量测定[3]
2.1.1 色谱条件 Agilent XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈-水(14∶86)；检测波长238 nm；流速1 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量5 μL。
2.1.2 线性关系及范围 精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含栀子苷564 μg的对照品溶液，作为储备液。将储备液稀释成不同浓度，分别注入高效液相色谱仪进行测定。以对照品峰面积(Y)为纵坐标，以栀子苷质量浓度(mg·L-1，X)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y=6 761.6X+8 421.6，r=0.999 5。结果表明，栀子苷在4.7～564 mg·L-1线性关系良好。
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2.2 栀子缓释片的制备及以栀子苷为代表成分评价其体外释放
2.2.1 栀子缓释片的制备 依筛选后处方量，称取栀子提取物、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素及微粉硅胶，均匀混合后，过100目筛，用φ9 mm浅凹冲模于压片机上以全粉末直接压片法压片，即得。经考察，粉末流动性和可压性可满足全粉末直接压片的要求。
2.2.2 以栀子苷为代表成分评价栀子缓释片的体外释放试验 采用《中国药典》2010年版二部附录XC 溶出度测定法中第三法，即小杯法。量取经脱气处理的新鲜水250 mL注入每个操作容器内，设置转速为100 r·min-1，温度为(37±0.5)℃。分别在1，2，4，6，8，10，12 h 取样1 mL(及时补充同温同体积水)，0.45 μm微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算峰面积。根据公式计算栀子苷累积释放度，以时间(h)为横坐标，累积释放度(%)为纵坐标绘制栀子苷累积释放度曲线，见图1。
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2.3 以DPPH试验评价栀子缓释制剂的体外释放
1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl， DPPH)[4]具有单一电子，是一种稳定的有机自由基，能接受一个电子或氢离子，在波长为517 nm下具有最大吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度下降，且下降程度呈线性关系[5]，这有利于药物清除DPPH自由基量效关系的建立，为以DPPH抗氧化活性评价栀子缓释片体外释放行为提供基础。
2.3.1 栀子提取物抗氧化能力测定方法 使用96孔酶标板，每孔加入30 μL栀子提取物溶液和200 μL DPPH溶液，室温下避光反应30 min，酶标仪测定吸光度，进行栀子提取物抗氧化能力测定，平行3份。不同组别的加样方法与加样量见表1。
清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，式中Ai为实验组吸光度；Aj为空白组吸光度；A0为对照组吸光度。
2.3.2 DPPH试验方法学考察 专属性考察：按2.3.1项下方法考察空白辅料对DPPH清除率的作用。以药物全部释放时辅料的浓度为储备液A，将储备液依次对半稀释至浓度A/2，A/4，结果表明，不同浓度空白辅料的吸光度与空白DPPH均无差异，因此空白辅料对DPPH无清除作用。, http://www.100md.com(郭懿望 赵壮 程艳珂 王笛 杜守颖 陆洋)
[关键词]栀子； 缓释； DPPH自由基； 药效指标
建立能够真实、客观评价中药缓释制剂的评价体系存在较大困难，这已成为中药现代化进程的绊脚石。因为中药成分复杂，性质多样，使得中药缓控释制剂难以模仿化药的评价模式而对个别已知成分的释放行为进行评价。因此，如何立足中药作用的整体性来选择中药缓控释制剂释放性能的指标，已成为当前的研究热点，对此有学者提出计量生物效应评价法[1]。
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计量生物效应评价法尝试避开中药药效物质不明、量化研究不系统的不足，选择一种新思路建立评价体系[2]。本实验选择栀子提取物亲水凝胶骨架缓释片作为模型药制剂，以DPPH自由基清除率为抗氧化活性指标，探讨提取物与DPPH清除率的量效关系，并将所建方法应用在栀子提取物缓释片的体外释放评价上，同时以栀子苷为成分指标，考察成分指标与药效指标的相关性，为以环烯醚萜类为主要成分的栀子缓释片体外释放的评价研究提供新思路。
1 材料
Prominence LC-20A型高效液相色谱仪(四元泵，SIL-20A自动进样器，CTO-10AS柱温箱，SPD-20A US-VIS检测器，岛津工作站；日本岛津)；KQ5200DA型数据超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Multiskan GO全波长酶标仪(美国thermo fisher scientific)；96孔酶标板(Corning公司)。
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栀子提取物(实验室自制，批号140221)；DPPH(日本东京化成工业株式会社，批号 08110127)；羟丙基甲基纤维素(上海卡乐康包衣技术有限公司提供，批号IF10824)；微晶纤维素(北京凤礼精求商贸有限责任公司，批号20130805)；栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110749-201115)。
2 方法与结果
2.1 栀子苷的含量测定[3]
2.1.1 色谱条件 Agilent XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈-水(14∶86)；检测波长238 nm；流速1 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量5 μL。
2.1.2 线性关系及范围 精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含栀子苷564 μg的对照品溶液，作为储备液。将储备液稀释成不同浓度，分别注入高效液相色谱仪进行测定。以对照品峰面积(Y)为纵坐标，以栀子苷质量浓度(mg·L-1，X)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y=6 761.6X+8 421.6，r=0.999 5。结果表明，栀子苷在4.7～564 mg·L-1线性关系良好。
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2.2 栀子缓释片的制备及以栀子苷为代表成分评价其体外释放
2.2.1 栀子缓释片的制备 依筛选后处方量，称取栀子提取物、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素及微粉硅胶，均匀混合后，过100目筛，用φ9 mm浅凹冲模于压片机上以全粉末直接压片法压片，即得。经考察，粉末流动性和可压性可满足全粉末直接压片的要求。
2.2.2 以栀子苷为代表成分评价栀子缓释片的体外释放试验 采用《中国药典》2010年版二部附录XC 溶出度测定法中第三法，即小杯法。量取经脱气处理的新鲜水250 mL注入每个操作容器内，设置转速为100 r·min-1，温度为(37±0.5)℃。分别在1，2，4，6，8，10，12 h 取样1 mL(及时补充同温同体积水)，0.45 μm微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算峰面积。根据公式计算栀子苷累积释放度，以时间(h)为横坐标，累积释放度(%)为纵坐标绘制栀子苷累积释放度曲线，见图1。
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2.3 以DPPH试验评价栀子缓释制剂的体外释放
1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl， DPPH)[4]具有单一电子，是一种稳定的有机自由基，能接受一个电子或氢离子，在波长为517 nm下具有最大吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度下降，且下降程度呈线性关系[5]，这有利于药物清除DPPH自由基量效关系的建立，为以DPPH抗氧化活性评价栀子缓释片体外释放行为提供基础。
2.3.1 栀子提取物抗氧化能力测定方法 使用96孔酶标板，每孔加入30 μL栀子提取物溶液和200 μL DPPH溶液，室温下避光反应30 min，酶标仪测定吸光度，进行栀子提取物抗氧化能力测定，平行3份。不同组别的加样方法与加样量见表1。
清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，式中Ai为实验组吸光度；Aj为空白组吸光度；A0为对照组吸光度。
2.3.2 DPPH试验方法学考察 专属性考察：按2.3.1项下方法考察空白辅料对DPPH清除率的作用。以药物全部释放时辅料的浓度为储备液A，将储备液依次对半稀释至浓度A/2，A/4，结果表明，不同浓度空白辅料的吸光度与空白DPPH均无差异，因此空白辅料对DPPH无清除作用。, http://www.100md.com(郭懿望 赵壮 程艳珂 王笛 杜守颖 陆洋)