中药通关藤红外指纹图谱研究(1)
[摘要]采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术对4省份16产区的48份通关藤样品进行分析，建立通关藤药材FTIR指纹图谱。通过对该指纹图谱的解析表征、全谱对比、共有特征峰对比、主成分分析和聚类分析等方法，建立快速鉴别不同产地通关藤的方法。结果表明，不同产地通关藤样品的FTIR图谱存在一定的差异性，运用适当的化学计量学方法可实现该药材的产地鉴别；指纹图谱解析、相关系数分析、主成分分析和聚类分析等结果能从不同层面对通关藤产地进行正确的分类，结果相互验证和补充。本研究为通关藤药材的产地鉴别和质量控制提供了一种新的技术和方法。
[关键词]通关藤； FTIR指纹图谱； 相关系数； 主成分分析； 聚类分析
通关藤，亦称为通光藤、乌骨藤、奶浆藤等[1]，系萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima干燥藤茎，始载于《滇南本草》[2]。其味苦，性甘、凉，入肺、胃、膀胱经；具有清热解毒、止咳平喘、调节免疫等功效，主要分布于云南、贵州、广西和四川等地[3-4]。通关藤提取物中含有的多种C21甾体化合物，以其为主要原料制备而成的消癌平制剂，在临床上用于治疗各种恶性肿瘤，疗效良好[5-8]。
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通关藤优质产区位于云南省红河州，传统用药和临床制剂的原材料均产于该地区。由于市场需求量日益扩增，仅依靠优质产区药材已无法满足市场需求，致使其采收范围无序扩大。但是不同产地药材质量的差异仅有少量文献报道[9-10]，如何对不同产地来源的通关藤进行鉴别更是少有研究[11]。傅里叶变换红外光谱技术具有操作简单、快速、准确等优点，可以更为合理、有效地鉴别评价中药材的产地来源，因而在中药材质量评价和产地鉴别方面得到广泛应用[12-16]。
1 材料与方法
1.1 材料
于2013年4月至7月，从云南省、广西省、四川省和贵州省采集野生状态的通关藤，每个省选取通关藤的主要分布区，所有样品均为作者采集，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为通关藤M. tenacissima，样本材料详见表 1。将通关藤样品切段并于60 ℃烘箱中烘至完全干燥，粉碎过100目筛，备用。
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1.2 方法
红外光谱分析过程中室内温度保持在22～27 ℃，空气相对湿度保持在30%～40%，每个压片累积扫描次数32次，扫描时扣除H2O和CO2的干扰。
精确称取各待测样品1.0 mg并分别与200 mg溴化钾(碎晶体)混合，研磨充分，压制成厚度约1 mm的透明锭片，然后放入红外光谱仪测定。每个产地制备3个样品片，以溴化钾为背景，每个样品片随机扫描3个不同的位置，获得3个光谱图，取其平均谱图作为最后的样品谱图。
得到的原始光谱数据经过Bruker OPUS 6.3软件进行多点基线校正，除去基线影响；进行自动9点平滑，消除噪声；进行标准归一化，去除不同样本称量的差异；应用SPSS 18.0软件选取指纹区域1 800～600 cm-1做主成分分析、聚类分析等；应用Origin7.5软件绘制分析图谱。
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1.3 方法学考察
1.3.1 精密度试验 取同一通关藤样品，参照1.2测定方法，连续测定5次，得到5个红外谱图，计算其共有峰波数的相对标准偏差。
1.3.2 稳定性试验 取同一通关藤样品，参照1.2测定方法，分别于0，2，4，8，24 h测定，得到5个红外光谱图，计算其共有峰波数的相对标准偏差。
1.3.3 重复性试验 取同一通关藤样品，称取5份平行样，按照1.2测定方法，测定其红外光谱，得到5个谱图后，计算共有峰波数的相对标准偏差。
2 结果与分析
2.1 方法学考察精密度考察结果表明，共有峰波数的相对标准偏差均小于0.09%；稳定性考察结果表明，共有峰波数的相对标准偏差为0.05%～3.35%，24 h内样品稳定；重复性考察结果表明，共有峰波数的相对标准偏差在0.09%～5.45%。说明该方法可靠、重复性好、稳定性强，符合指纹图谱的要求。
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2.2 对照FTIR图谱
以共有模式建立通关藤对照红外指纹图谱，选择优质产区(云南省红河州)并且经传统经验鉴定品质较好的5个产地(金平，个旧，蒙自，建水，石屏)共15批次样品作为对照药材。每份样品不同位置随机扫描3次，最终以吸收强度均值作为对照图谱的吸收强度，得到的红外图谱见图1。
2.3 对照FTIR图谱解析及表征
3 415 cm-1附近谱带较宽，频率低的吸收峰为N-H及O-H的伸缩振动峰；2 927 cm-1附近的吸收峰C-H伸缩振动峰；2 358 cm-1附近为CO2吸收峰；1 628 cm-1处附近的吸收峰为C=O或C=C的伸缩振动峰；在1 321 cm-1处的吸收峰为C-O伸缩振动峰；在1 041 cm-1处为苷类，多糖类等碳水化合物的C-O弯曲振动；在661 cm-1处为C-Cl的伸缩振动峰。
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2.4 通关藤FTIR指纹图谱相似度分析
本研究分别进行全谱及共有特征峰的相似度分析，这样既能突出共有峰的特点，又能最大程度地将全谱信息强度和位置差异体现出来，比目前常用的方法更为全面和准确，极大地提高了样品间的可比性和比较的精度。
2.4.1 通关藤FTIR指纹图谱共有特征峰的相似度分析 经过对所有样品红外光谱的比较，发现共有特征峰为661，1 041，1 321，1 628，2 358，2 927，3 415 cm-1 (每个通关藤样品的吸收峰差异不超过±4 cm-1)。将每个样品的共有特征峰与对照FTIR图谱的共有特征峰进行相似度分析，见表2 。通过对不同产地通关藤样品共有特征峰相关系数的比较分析，可以将其FTIR图谱分为3类。第1类：云南省红河州地区及相邻周边产的通关藤。该区域所产通关藤药材的相关系数在0.988 5以上，与优质产区药材相似度较高。主要包括：金平县、个旧市、蒙自市、建水县、石屏县、马关县和宁洱县。第2类：主要包括靖西县、兴仁县及永德县。该区域所产通关藤药材的相关系数在0.983 5～0.988 5。第3类：主要包括勐腊县、那坡县、隆林县、镇宁县和德昌县。该地区所产通关藤相关系数均在0.980 0以下，与优质产地药材相似度较低。, http://www.100md.com(李超 杨生超 郭巧生 郑开颜 王平理 徐祥增 肖雪峰)
[关键词]通关藤； FTIR指纹图谱； 相关系数； 主成分分析； 聚类分析
通关藤，亦称为通光藤、乌骨藤、奶浆藤等[1]，系萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima干燥藤茎，始载于《滇南本草》[2]。其味苦，性甘、凉，入肺、胃、膀胱经；具有清热解毒、止咳平喘、调节免疫等功效，主要分布于云南、贵州、广西和四川等地[3-4]。通关藤提取物中含有的多种C21甾体化合物，以其为主要原料制备而成的消癌平制剂，在临床上用于治疗各种恶性肿瘤，疗效良好[5-8]。
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通关藤优质产区位于云南省红河州，传统用药和临床制剂的原材料均产于该地区。由于市场需求量日益扩增，仅依靠优质产区药材已无法满足市场需求，致使其采收范围无序扩大。但是不同产地药材质量的差异仅有少量文献报道[9-10]，如何对不同产地来源的通关藤进行鉴别更是少有研究[11]。傅里叶变换红外光谱技术具有操作简单、快速、准确等优点，可以更为合理、有效地鉴别评价中药材的产地来源，因而在中药材质量评价和产地鉴别方面得到广泛应用[12-16]。
1 材料与方法
1.1 材料
于2013年4月至7月，从云南省、广西省、四川省和贵州省采集野生状态的通关藤，每个省选取通关藤的主要分布区，所有样品均为作者采集，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为通关藤M. tenacissima，样本材料详见表 1。将通关藤样品切段并于60 ℃烘箱中烘至完全干燥，粉碎过100目筛，备用。
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1.2 方法
红外光谱分析过程中室内温度保持在22～27 ℃，空气相对湿度保持在30%～40%，每个压片累积扫描次数32次，扫描时扣除H2O和CO2的干扰。
精确称取各待测样品1.0 mg并分别与200 mg溴化钾(碎晶体)混合，研磨充分，压制成厚度约1 mm的透明锭片，然后放入红外光谱仪测定。每个产地制备3个样品片，以溴化钾为背景，每个样品片随机扫描3个不同的位置，获得3个光谱图，取其平均谱图作为最后的样品谱图。
得到的原始光谱数据经过Bruker OPUS 6.3软件进行多点基线校正，除去基线影响；进行自动9点平滑，消除噪声；进行标准归一化，去除不同样本称量的差异；应用SPSS 18.0软件选取指纹区域1 800～600 cm-1做主成分分析、聚类分析等；应用Origin7.5软件绘制分析图谱。
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1.3 方法学考察
1.3.1 精密度试验 取同一通关藤样品，参照1.2测定方法，连续测定5次，得到5个红外谱图，计算其共有峰波数的相对标准偏差。
1.3.2 稳定性试验 取同一通关藤样品，参照1.2测定方法，分别于0，2，4，8，24 h测定，得到5个红外光谱图，计算其共有峰波数的相对标准偏差。
1.3.3 重复性试验 取同一通关藤样品，称取5份平行样，按照1.2测定方法，测定其红外光谱，得到5个谱图后，计算共有峰波数的相对标准偏差。
2 结果与分析
2.1 方法学考察精密度考察结果表明，共有峰波数的相对标准偏差均小于0.09%；稳定性考察结果表明，共有峰波数的相对标准偏差为0.05%～3.35%，24 h内样品稳定；重复性考察结果表明，共有峰波数的相对标准偏差在0.09%～5.45%。说明该方法可靠、重复性好、稳定性强，符合指纹图谱的要求。
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2.2 对照FTIR图谱
以共有模式建立通关藤对照红外指纹图谱，选择优质产区(云南省红河州)并且经传统经验鉴定品质较好的5个产地(金平，个旧，蒙自，建水，石屏)共15批次样品作为对照药材。每份样品不同位置随机扫描3次，最终以吸收强度均值作为对照图谱的吸收强度，得到的红外图谱见图1。
2.3 对照FTIR图谱解析及表征
3 415 cm-1附近谱带较宽，频率低的吸收峰为N-H及O-H的伸缩振动峰；2 927 cm-1附近的吸收峰C-H伸缩振动峰；2 358 cm-1附近为CO2吸收峰；1 628 cm-1处附近的吸收峰为C=O或C=C的伸缩振动峰；在1 321 cm-1处的吸收峰为C-O伸缩振动峰；在1 041 cm-1处为苷类，多糖类等碳水化合物的C-O弯曲振动；在661 cm-1处为C-Cl的伸缩振动峰。
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2.4 通关藤FTIR指纹图谱相似度分析
本研究分别进行全谱及共有特征峰的相似度分析，这样既能突出共有峰的特点，又能最大程度地将全谱信息强度和位置差异体现出来，比目前常用的方法更为全面和准确，极大地提高了样品间的可比性和比较的精度。
2.4.1 通关藤FTIR指纹图谱共有特征峰的相似度分析 经过对所有样品红外光谱的比较，发现共有特征峰为661，1 041，1 321，1 628，2 358，2 927，3 415 cm-1 (每个通关藤样品的吸收峰差异不超过±4 cm-1)。将每个样品的共有特征峰与对照FTIR图谱的共有特征峰进行相似度分析，见表2 。通过对不同产地通关藤样品共有特征峰相关系数的比较分析，可以将其FTIR图谱分为3类。第1类：云南省红河州地区及相邻周边产的通关藤。该区域所产通关藤药材的相关系数在0.988 5以上，与优质产区药材相似度较高。主要包括：金平县、个旧市、蒙自市、建水县、石屏县、马关县和宁洱县。第2类：主要包括靖西县、兴仁县及永德县。该区域所产通关藤药材的相关系数在0.983 5～0.988 5。第3类：主要包括勐腊县、那坡县、隆林县、镇宁县和德昌县。该地区所产通关藤相关系数均在0.980 0以下，与优质产地药材相似度较低。, http://www.100md.com(李超 杨生超 郭巧生 郑开颜 王平理 徐祥增 肖雪峰)