蛹虫草多糖的分离纯化及促胆固醇逆向转运研究(1)
[摘要]对蛹虫草子实体多糖进行分离纯化、相对分子质量测定、单糖组成分析和体内胆固醇逆向转运活性研究。采用阴离子交换色谱、分子排阻色谱分离纯化多糖，高效凝胶渗透色谱法测定相对分子质量，高效液相色谱结合柱前衍生法测定单糖组成，同位素示踪技术评价胆固醇转运活性。最终获得3种纯多糖组分CMBW1， CMBW2和CMYW1，糖含量依次为87%， 89%， 95%，蛋白含量依次为6.5%， 1.3%， 2.8%，相对分子质量依次为772.1， 20.9， 13.2 kDa；CMBW1由Man， GlcN， Rha， GlcUA， Glc， Gal和Ara构成， 摩尔比例为7.25∶0.17∶1.29∶0.23∶6.30∶11.08∶0.79；CMBW2由Man， GlcN， Gal和Ara组成，摩尔比例为2.40∶0.16∶2.92∶0.24；CMYW1由Man， GlcN， GlcUA和Glc组成，摩尔比例为0.59∶0.57∶0.45∶25.61；蛹虫草多糖50 mg·kg-1即可显著促进3H-胆固醇向小鼠血液转运和经由粪便排出。所得3种蛹虫草多糖组分均为杂多糖，所得蛹虫草多糖具有促胆固醇逆向转运功能。
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[关键词]蛹虫草多糖；分离纯化；单糖组成；胆固醇逆向转运
冬虫夏草具有抑制肿瘤生产、增强机体免疫力、降脂、抗菌等功能；但冬虫夏草自然资源稀少、价格昂贵、人工栽培困难等问题，制约着冬虫夏草应用推广。蛹虫草Cordyceps militaris L. Link又名北虫草、北冬虫夏草等，其与冬虫夏草属于同属真菌，不仅具有与冬虫夏草相近的生物活性，且易于人工培养。蛹虫草多糖是蛹虫草含量较高的生物活性物质之一，研究发现蛹虫草多糖具有增强免疫[1]、抗肿瘤 [2-3]、抗病毒、抗衰老、降血糖等多种功能。
近年研究发现蛹虫草多糖具有类似于冬虫夏草多糖的生物活性[4-6]。蛹虫草多糖的单糖组成、相对分子质量、糖苷键连接方式可对其生物活性产生重要影响。单纯的水提醇沉法获得多糖的方法工艺流程简单，但获得的多糖相对分子质量范围广，组成成分复杂，不利于多糖构-效关系的阐述，又不利于产品质量的控制。2013年至今，先后有国内外研究者报道了蛹虫草的降脂效果[7-8]，而胆固醇逆向转运是药物降脂的重要一环。本文以人工培养获得的蛹虫草子实体为原料，采用先进的柱色谱手段对蛹虫草多糖进行分离纯化、单糖组成分析、相对分子质量测定，并对蛹虫草中的多糖成分是否具有胆固醇逆向转运活性进行了初步研究。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 蛹虫草子实体(泰安市岱珍营养保健食品有限公司提供)；Q-sepharoseTM Fast Flow和Sephacryl S200HR柱填料(美国GE Healthcare)；葡萄糖(Glc)，甘露糖(Man)，半乳糖(Gal)，阿拉伯糖(Ara)，岩藻糖(Fuc)，鼠李糖(Rha)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、木糖(Xyl)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、葡萄糖胺(GlcN)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，乙腈，Dextran 对照品(相对分子质量1 100.0， 667.8， 409.8， 273.0， 147.6， 48.6， 23.8， 11.6， 5.0 kDa)购于Sigma-Aldrich；3H标记胆固醇购于北京(中国)同位素公司；BCA蛋白定量分析试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)；透析袋(MWCO 8000-14000)(北京Solarbio科技有限公司)；其余试剂均为分析纯。
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1.1.2 仪器 ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国Agilent公司)；TOSOH TSKgel G5000PWXL不锈钢色谱柱(7.8 mm×300 mm)(日本TOSOH公司)；阴离子交换色谱柱(5 cm×40 cm)和分子排阻色谱柱(1.6 cm×100 cm)(中国上海康华生化仪器制造厂)；BSZ-100自动部分收集器(中国上海青浦沪西仪器厂)；快速蛋白纯化系统(AKTA-FPLC)(美国GE公司)；2695型高效液相色谱(HPLC)(美国Waters公司)；RID -10A示差折光检测器(日本Shimaduz公司)；Laboroto-4002型低压旋转蒸发仪(德国Heidolph集团)；FD-1C-50 低温冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；TDL-5000B型低速冷冻离心机(中国上海嘉鹏科技有限公司)；液体闪烁计数仪LS-6500(美国Beckman公司)。
1.1.3 动物 22周雄性C57 BL/6小鼠购自北京大学实验动物中心，合格证号SCXK2009-0004。
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1.2 方法
1.2.1 多糖的提取及纯化 烘干的蛹虫草子实体、粉碎、乙醇脱脂、热水回流提取、提取液经浓缩、分级醇沉、透析、冷冻干燥得蛹虫草多糖。多糖重溶于去离子水中，配制成10 g·L-1的溶液进行Q-SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱色谱(5.0 cm × 40 cm)，采用AKTA-FPLC进行线性洗脱，洗脱溶液为浓度0～2.0 mol·L-1的氯化钠溶液。采用自动收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测并绘制洗脱曲线 [7-8]。再采用Sephacryl S200HR凝胶柱(1.6 cm×100 cm)对经阴离子交换柱色谱后所得的各洗脱组分作进一步的分离纯化，采用AKTA-FPLC进行梯度洗脱。凝胶柱装柱后采用0.2 mol·L-1的碳酸氢铵溶液平衡48 h，流速为18 mL·h-1。自动收集器5 mL每管收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测并绘制洗脱曲线。据洗脱曲线分别收集相应的多糖洗脱组分，低压旋转蒸发仪除去碳酸氢铵，冷冻干燥，得纯化后的多糖组分[9-11]。, http://www.100md.com(郭守东 崔英杰 王仁重 王仁远 武文雪 马腾)
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[关键词]蛹虫草多糖；分离纯化；单糖组成；胆固醇逆向转运
冬虫夏草具有抑制肿瘤生产、增强机体免疫力、降脂、抗菌等功能；但冬虫夏草自然资源稀少、价格昂贵、人工栽培困难等问题，制约着冬虫夏草应用推广。蛹虫草Cordyceps militaris L. Link又名北虫草、北冬虫夏草等，其与冬虫夏草属于同属真菌，不仅具有与冬虫夏草相近的生物活性，且易于人工培养。蛹虫草多糖是蛹虫草含量较高的生物活性物质之一，研究发现蛹虫草多糖具有增强免疫[1]、抗肿瘤 [2-3]、抗病毒、抗衰老、降血糖等多种功能。
近年研究发现蛹虫草多糖具有类似于冬虫夏草多糖的生物活性[4-6]。蛹虫草多糖的单糖组成、相对分子质量、糖苷键连接方式可对其生物活性产生重要影响。单纯的水提醇沉法获得多糖的方法工艺流程简单，但获得的多糖相对分子质量范围广，组成成分复杂，不利于多糖构-效关系的阐述，又不利于产品质量的控制。2013年至今，先后有国内外研究者报道了蛹虫草的降脂效果[7-8]，而胆固醇逆向转运是药物降脂的重要一环。本文以人工培养获得的蛹虫草子实体为原料，采用先进的柱色谱手段对蛹虫草多糖进行分离纯化、单糖组成分析、相对分子质量测定，并对蛹虫草中的多糖成分是否具有胆固醇逆向转运活性进行了初步研究。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 蛹虫草子实体(泰安市岱珍营养保健食品有限公司提供)；Q-sepharoseTM Fast Flow和Sephacryl S200HR柱填料(美国GE Healthcare)；葡萄糖(Glc)，甘露糖(Man)，半乳糖(Gal)，阿拉伯糖(Ara)，岩藻糖(Fuc)，鼠李糖(Rha)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、木糖(Xyl)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、葡萄糖胺(GlcN)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，乙腈，Dextran 对照品(相对分子质量1 100.0， 667.8， 409.8， 273.0， 147.6， 48.6， 23.8， 11.6， 5.0 kDa)购于Sigma-Aldrich；3H标记胆固醇购于北京(中国)同位素公司；BCA蛋白定量分析试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)；透析袋(MWCO 8000-14000)(北京Solarbio科技有限公司)；其余试剂均为分析纯。
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1.1.2 仪器 ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国Agilent公司)；TOSOH TSKgel G5000PWXL不锈钢色谱柱(7.8 mm×300 mm)(日本TOSOH公司)；阴离子交换色谱柱(5 cm×40 cm)和分子排阻色谱柱(1.6 cm×100 cm)(中国上海康华生化仪器制造厂)；BSZ-100自动部分收集器(中国上海青浦沪西仪器厂)；快速蛋白纯化系统(AKTA-FPLC)(美国GE公司)；2695型高效液相色谱(HPLC)(美国Waters公司)；RID -10A示差折光检测器(日本Shimaduz公司)；Laboroto-4002型低压旋转蒸发仪(德国Heidolph集团)；FD-1C-50 低温冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；TDL-5000B型低速冷冻离心机(中国上海嘉鹏科技有限公司)；液体闪烁计数仪LS-6500(美国Beckman公司)。
1.1.3 动物 22周雄性C57 BL/6小鼠购自北京大学实验动物中心，合格证号SCXK2009-0004。
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1.2 方法
1.2.1 多糖的提取及纯化 烘干的蛹虫草子实体、粉碎、乙醇脱脂、热水回流提取、提取液经浓缩、分级醇沉、透析、冷冻干燥得蛹虫草多糖。多糖重溶于去离子水中，配制成10 g·L-1的溶液进行Q-SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱色谱(5.0 cm × 40 cm)，采用AKTA-FPLC进行线性洗脱，洗脱溶液为浓度0～2.0 mol·L-1的氯化钠溶液。采用自动收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测并绘制洗脱曲线 [7-8]。再采用Sephacryl S200HR凝胶柱(1.6 cm×100 cm)对经阴离子交换柱色谱后所得的各洗脱组分作进一步的分离纯化，采用AKTA-FPLC进行梯度洗脱。凝胶柱装柱后采用0.2 mol·L-1的碳酸氢铵溶液平衡48 h，流速为18 mL·h-1。自动收集器5 mL每管收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测并绘制洗脱曲线。据洗脱曲线分别收集相应的多糖洗脱组分，低压旋转蒸发仪除去碳酸氢铵，冷冻干燥，得纯化后的多糖组分[9-11]。, http://www.100md.com(郭守东 崔英杰 王仁重 王仁远 武文雪 马腾)