穿心莲内酯对白念珠菌生物膜分散的影响(1)
[摘要]随着真菌感染日渐增多，白念珠菌的防治成为当前抗真菌感染的重点。该研究拟探讨中药单体穿心莲内酯(AG)对白念珠菌生物膜分散的影响。实验以微孔板结合医用导管片构建白念珠菌生物膜模型，分别通过XTT减低法和平板法发现1 000，500，250 mg·L-1AG 能不同程度的影响白念珠菌生物膜分散细胞的活性；以扫描电镜观察导管片残余生物膜形态结构，发现1 000，500，250 mg·L-1AG能剂量依赖性的诱导白念珠菌生物膜的分散，且分散出的细胞以酵母相为主；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测发现AG使HSP90表达上调，使UME6和PES1表达下调。该研究表明AG能一定程度的诱导白念珠菌生物膜分散。
[关键词]穿心莲内酯；白念珠菌；生物膜；分散
近年来，白念珠菌作为条件致病菌所引起的真菌感染病例日益增多，其致病性与形成生物膜密切相关，而后者是导致其高度耐药性和反复感染的重要原因，生物膜成熟周期包括黏附、形成微菌落、释放胞外多聚物、形成成熟稳定的三维结构及后期生物膜细胞的分散(dispersion)等阶段，而从生物膜上分散下来的细胞易造成菌细胞定植至新的部位，造成感染的播散[1]。
, http://www.100md.com
穿心莲内酯(andrographolide，AG)是从穿心莲的全草或叶中分离的二萜类化合物，有较显著的抗细菌、真菌和肿瘤效果。本课题组在前期研究中发现，中药单体AG对白念珠菌生物膜形成具有一定的抑制作用，能明显抑制体外白念珠菌的黏附以及介导白念珠菌凋亡[2-4]。为较系统地研究AG对白念珠菌生物膜整个发育周期的影响，故在前期研究基础上考察其对白念珠菌生物膜分散干预的效果。
1 材料
1.1 菌株 白念珠菌Candida albicans SC5314，由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。
1.2 药物与试剂 穿心莲内酯(中国食品药品检定研究院，批号110797-201108)。25%戊二醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)；DMSO(博美生物科技有限公司)；XTT(加拿大BBI公司)；维生素K3(美国Alexis公司)；PBS缓冲液(本室配制)；Total RNA提取试剂(日本ToyoBo公司)；PCR试剂(日本ToyoBo公司)。RPMI-1640 液体培养基(pH 7.0±0.1)，滤过灭菌，4 ℃保存备用。
, 百拇医药
1.3 仪器 12孔培养板(美国Corning公司)；SpectraMax M2e 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)；ABI7000荧光定量PCR仪(美国生物应用系统公司)。
2 方法
2.1 白念珠菌液和导管片的制备[5] 从4 ℃保存的沙氏培养基上挑取白念珠菌单个菌落，接种于RPMI-1640培养基，于37 ℃培养箱孵育，使白念珠菌处于生长对数期后再次活化，血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养基稀释浓度至2×106 CFU·mL-1备用。将医用聚氨酯导管(直径2.4 mm)裁割长为1 cm，75%乙醇过夜除菌，再以胎牛血清浸泡37 ℃过夜，用PBS缓冲液轻洗2次待用。
2.2 白念珠菌生物膜分散实验 将白念珠菌浓度用RPMI-1640培养基调整为2×106 CFU·mL-1，导管片放入12孔板，每孔加入2 mL菌液，37 ℃孵育24 h。无菌条件下弃去菌液，取出黏附有生物膜的导管片，以灭菌PBS缓冲液清洗3遍，除去导管片表面未黏附细胞，置于新的12孔板，加入含AG培养基(终浓度为1 000，500，250 mg·L-1)2 mL，氟康唑对照组(FLC，256 mg·L-1)，同时设空白对照组，分别培养2，8，12，24 h。
, http://www.100md.com
2.3 XTT法检测来自生物膜的分散细胞活性 以0.5 g·L-1林格液配制XTT并用0.22 μm孔径过滤器除菌，临用前加入维生素K3(menadione，浓度10 mmol·L-1)。分别于AG作用2，8，12，24 h后，取出导管，充分混匀菌悬液，取100 μL 加入新96孔板，加XTT-维生素K3溶液60 μL，37 ℃避光培养2 h。酶标仪492 nm检测吸光度A。实验重复3次，每浓度设置3复孔，取平均值。
2.4 导管片残余生物膜CFU计数 AG作用生物膜2，8，12，24 h后，从12孔板中取出导管片，用PBS缓冲液轻洗导管片2次后，振荡仪涡旋30 s，超声仪4万Hz超声5 min，使生物膜从导管片上脱离下来。将菌悬液按1∶10系列稀释后，取适量均匀涂于沙氏琼脂平皿，37 ℃培养48 h后计数CFU。实验重复3次，取平均值。
2.5 扫描电镜检查残余生物膜形态结构 将待检测的导管片标本，以PBS缓冲液轻洗2次，预冷2.5%戊二醛溶液避光固定3 h，PBS缓冲液轻洗2次，乙醇梯度脱水(30%，10 min；70%，10 min；100%，10 min)，过夜干燥后镀金，扫描电镜观察并拍照。
2.6 AG对白念珠菌生物膜分散相关基因表达的测定[6] 基因表达实验检测AG对白念珠菌生物膜分散相关基因HSP90，UME6和PES1的影响。在AG干预24 h后，3 000 r·min-1离心5 min收集菌体后进行总RNA提取。提取过程参照MagExtractor-RNA提取试剂盒说明书进行。据NCBI基因库查得基因序列，并用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物(表1)。, 百拇医药(施高翔 严园园 邵菁 陆克乔 张梦翔 汪天明 汪长中)
[关键词]穿心莲内酯；白念珠菌；生物膜；分散
近年来，白念珠菌作为条件致病菌所引起的真菌感染病例日益增多，其致病性与形成生物膜密切相关，而后者是导致其高度耐药性和反复感染的重要原因，生物膜成熟周期包括黏附、形成微菌落、释放胞外多聚物、形成成熟稳定的三维结构及后期生物膜细胞的分散(dispersion)等阶段，而从生物膜上分散下来的细胞易造成菌细胞定植至新的部位，造成感染的播散[1]。
, http://www.100md.com
穿心莲内酯(andrographolide，AG)是从穿心莲的全草或叶中分离的二萜类化合物，有较显著的抗细菌、真菌和肿瘤效果。本课题组在前期研究中发现，中药单体AG对白念珠菌生物膜形成具有一定的抑制作用，能明显抑制体外白念珠菌的黏附以及介导白念珠菌凋亡[2-4]。为较系统地研究AG对白念珠菌生物膜整个发育周期的影响，故在前期研究基础上考察其对白念珠菌生物膜分散干预的效果。
1 材料
1.1 菌株 白念珠菌Candida albicans SC5314，由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。
1.2 药物与试剂 穿心莲内酯(中国食品药品检定研究院，批号110797-201108)。25%戊二醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)；DMSO(博美生物科技有限公司)；XTT(加拿大BBI公司)；维生素K3(美国Alexis公司)；PBS缓冲液(本室配制)；Total RNA提取试剂(日本ToyoBo公司)；PCR试剂(日本ToyoBo公司)。RPMI-1640 液体培养基(pH 7.0±0.1)，滤过灭菌，4 ℃保存备用。
, 百拇医药
1.3 仪器 12孔培养板(美国Corning公司)；SpectraMax M2e 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)；ABI7000荧光定量PCR仪(美国生物应用系统公司)。
2 方法
2.1 白念珠菌液和导管片的制备[5] 从4 ℃保存的沙氏培养基上挑取白念珠菌单个菌落，接种于RPMI-1640培养基，于37 ℃培养箱孵育，使白念珠菌处于生长对数期后再次活化，血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养基稀释浓度至2×106 CFU·mL-1备用。将医用聚氨酯导管(直径2.4 mm)裁割长为1 cm，75%乙醇过夜除菌，再以胎牛血清浸泡37 ℃过夜，用PBS缓冲液轻洗2次待用。
2.2 白念珠菌生物膜分散实验 将白念珠菌浓度用RPMI-1640培养基调整为2×106 CFU·mL-1，导管片放入12孔板，每孔加入2 mL菌液，37 ℃孵育24 h。无菌条件下弃去菌液，取出黏附有生物膜的导管片，以灭菌PBS缓冲液清洗3遍，除去导管片表面未黏附细胞，置于新的12孔板，加入含AG培养基(终浓度为1 000，500，250 mg·L-1)2 mL，氟康唑对照组(FLC，256 mg·L-1)，同时设空白对照组，分别培养2，8，12，24 h。
, http://www.100md.com
2.3 XTT法检测来自生物膜的分散细胞活性 以0.5 g·L-1林格液配制XTT并用0.22 μm孔径过滤器除菌，临用前加入维生素K3(menadione，浓度10 mmol·L-1)。分别于AG作用2，8，12，24 h后，取出导管，充分混匀菌悬液，取100 μL 加入新96孔板，加XTT-维生素K3溶液60 μL，37 ℃避光培养2 h。酶标仪492 nm检测吸光度A。实验重复3次，每浓度设置3复孔，取平均值。
2.4 导管片残余生物膜CFU计数 AG作用生物膜2，8，12，24 h后，从12孔板中取出导管片，用PBS缓冲液轻洗导管片2次后，振荡仪涡旋30 s，超声仪4万Hz超声5 min，使生物膜从导管片上脱离下来。将菌悬液按1∶10系列稀释后，取适量均匀涂于沙氏琼脂平皿，37 ℃培养48 h后计数CFU。实验重复3次，取平均值。
2.5 扫描电镜检查残余生物膜形态结构 将待检测的导管片标本，以PBS缓冲液轻洗2次，预冷2.5%戊二醛溶液避光固定3 h，PBS缓冲液轻洗2次，乙醇梯度脱水(30%，10 min；70%，10 min；100%，10 min)，过夜干燥后镀金，扫描电镜观察并拍照。
2.6 AG对白念珠菌生物膜分散相关基因表达的测定[6] 基因表达实验检测AG对白念珠菌生物膜分散相关基因HSP90，UME6和PES1的影响。在AG干预24 h后，3 000 r·min-1离心5 min收集菌体后进行总RNA提取。提取过程参照MagExtractor-RNA提取试剂盒说明书进行。据NCBI基因库查得基因序列，并用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物(表1)。, 百拇医药(施高翔 严园园 邵菁 陆克乔 张梦翔 汪天明 汪长中)