改进的线栓法对不同品系小鼠脑缺血模型的构建(1)
[摘要] 目的：建立不同品系小鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型的通用方法。方法：健康雄性昆明(KM)小鼠和C57BL/6小鼠各20只，随机分为对照组10只，MCAO组10只，改良线栓法制作小鼠MCAO模型；大脑中动脉血流监测，栓塞24 h后行神经行为学评分，TTC染色测定脑梗死体积百分比，对模型可靠性进行评价。结果：KM和C57BL/6小鼠MCAO模型组脑血流监测显示梗死处血流基值下降比分别为(81.65±4.59)%，(83.68±6.25)%，神经功能评分分别为(2.30±0.82)，(2.50±0.80)分，体征明显，TTC染色可清晰地显示出梗死范围且相对稳定，C57BL/6小鼠有1只TTC染色梗死灶不明显，24 h成活率KM和C57BL/6小鼠分别为100%，80%。结论：颈总插线法制作小鼠脑缺血模型无需开颅，创伤极小，缺血的部位较恒定，从模型制备中线栓、温度、麻醉各个关键环节加以优化和改良，使该模型的制备更加完备。
[关键词]小鼠；大脑中动脉栓塞；动物模型；插线法
, http://www.100md.com
脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，具有高致死率、高致残率和高复发率的特点，最新研究[1]显示，脑卒中已严重威胁人们的生命和生活质量。缺血性卒中是由于脑血管(主要为大脑中动脉)或其分支的血栓性或栓子性阻塞所致，约占所有类型卒中的80%[2]。大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型为目前研究局灶性脑缺血再灌注损伤最广泛的模型，该模型的经典方法为线栓法[3]，多运用于大鼠的研究。但大鼠成本高，且不能满足脑缺血基因水平研究，因此小鼠成为该实验动物的首选，但关于构建小鼠MCAO模型的研究不多[4]，且大鼠、小鼠体质、血管韧性、解剖结构等各方面的差异，因此需要构建完善的、理想的标准化小鼠脑缺血模型。
1 材料
1.1 动物 昆明小鼠，20只，雄性，体重(25±2) g，由军事医学科学院实验动物中心SPF实验室提供，许可证号SCXK-(军)2012-0004。C57BL/6小鼠，20只，雄性，体重(25±2) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。随机分为对照组10只，MCAO缺血组10只，术前12 h小鼠自由活动，禁食不禁水。
, 百拇医药
1.2 试剂 水合氯醛和多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20130321)，酒精(邯郸市捷利康商贸有限公司，批号131208)，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，美国Sigma公司，批号10109622)，小鼠线栓(广州赛迅生物技术有限公司)。
1.3 仪器 常规手术器械及显微手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂)，体式显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)，激光多普勒血流仪(瑞典Perimed公司)。
2 方法
2.1 线栓准备 将统一规定规格的线栓(头端直径0.23 mm±0.02 mm)利用记号笔在线栓头端9 mm处用记号笔标记，以便准确的控制进线的深度，将其消毒后备用。
2.2 手术步骤 小鼠称重，选取5%的水合氯醛以8 mL·kg-1比例腹腔注射麻醉，仰卧于手术台上，将颈部备皮乙醇消毒后，沿颈部正中进行切口，暴露并钝性分离下颌腺体，显微镜下在右侧的肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌和二腹肌形成的三角处分离出右侧的颈总动脉(CCA)，用电凝笔烫断游离出的小分支，分离出颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，仔细分离避免损伤迷走神经，舌、咽神经和气管，用5-0医用真丝编织线将ECA，CCA结扎，另在CCA上打一手术活结，颈内动脉用显微动脉夹夹闭，在颈总动脉上做一切口，将备好的线栓插入颈内动脉到标记处或者直到略感阻力为止，即插入线栓从颈外动脉分叉处9 mm左右，扎紧活结。此时，线栓前端已经阻断大脑中动脉(MCA)起始段及其所有血液供应，造成MCA局灶性缺血，缝合皮肤。手术过程中要保证室温恒定在25 ℃左右，手术结束后放置于恒温清洁笼中卫生饲养。对照组不做任何处理，假手术组按照实验组步骤处理，但是不插入线栓，观察动物情况。弃去手术超过15 min或手术中有出血及麻醉过深的动物。 通过激光多普勒脑血流仪测量小鼠大脑中动脉栓塞后的局部脑血流变化。监测大脑中动脉线栓阻断血流程度，证实模型的成功与否。
, 百拇医药
2.3 术后的神经功能评分及TTC染色 整个评分采用单肓法，即评分者不知道实验动物分组情况。采用Longa的5分评分标准[3](0分：无神经损伤症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：行走向对侧旋转；3分：爬行时身体向对侧倾倒；4分：不能自己行走或意识丧失)。1～4分为有效模型。 术后12，24 h后断头取脑，迅速置PBS冰水混合物中，5 min后取出置小鼠脑槽中，行1.0 mm厚的冠状切片，将切片立即置于0.5%TTC磷酸缓冲液中，避光、37 ℃恒温孵育15 min。将染色后脑片置于4%多聚甲醛中固定后，将脑片按脑的前后顺序整齐排列。用数码相机拍摄染色后的脑片，输入计算机内，用图像处理软件计算脑梗死面积。根据公式：体积=100×(对侧半球体积-未梗死的同侧半球体积)/对侧大脑半球体积[5]，算出梗死体积的百分比。
2.4 统计学方法 应用Image J软件对TTC染色结果进行图像分析。处理数据以±s表示，应用SPSS 17.0统计软件，行单因素方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 小鼠脑缺血后神经病学评分 MCAO造模3 h后，小鼠苏醒，恢复反射和自主活动。假手术组未见异常，模型组动物均出现提尾悬空时头向左歪，对侧前肢屈曲内收、肩内旋，肌张力降低，不能完全伸直，自主活动时以对侧后腿为圆心向对侧旋转，甚至倾斜，神经功能学评分结果见表1。, 百拇医药(贾蔷 石作荣 杨洪军)
[关键词]小鼠；大脑中动脉栓塞；动物模型；插线法
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脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，具有高致死率、高致残率和高复发率的特点，最新研究[1]显示，脑卒中已严重威胁人们的生命和生活质量。缺血性卒中是由于脑血管(主要为大脑中动脉)或其分支的血栓性或栓子性阻塞所致，约占所有类型卒中的80%[2]。大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型为目前研究局灶性脑缺血再灌注损伤最广泛的模型，该模型的经典方法为线栓法[3]，多运用于大鼠的研究。但大鼠成本高，且不能满足脑缺血基因水平研究，因此小鼠成为该实验动物的首选，但关于构建小鼠MCAO模型的研究不多[4]，且大鼠、小鼠体质、血管韧性、解剖结构等各方面的差异，因此需要构建完善的、理想的标准化小鼠脑缺血模型。
1 材料
1.1 动物 昆明小鼠，20只，雄性，体重(25±2) g，由军事医学科学院实验动物中心SPF实验室提供，许可证号SCXK-(军)2012-0004。C57BL/6小鼠，20只，雄性，体重(25±2) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。随机分为对照组10只，MCAO缺血组10只，术前12 h小鼠自由活动，禁食不禁水。
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1.2 试剂 水合氯醛和多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20130321)，酒精(邯郸市捷利康商贸有限公司，批号131208)，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，美国Sigma公司，批号10109622)，小鼠线栓(广州赛迅生物技术有限公司)。
1.3 仪器 常规手术器械及显微手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂)，体式显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)，激光多普勒血流仪(瑞典Perimed公司)。
2 方法
2.1 线栓准备 将统一规定规格的线栓(头端直径0.23 mm±0.02 mm)利用记号笔在线栓头端9 mm处用记号笔标记，以便准确的控制进线的深度，将其消毒后备用。
2.2 手术步骤 小鼠称重，选取5%的水合氯醛以8 mL·kg-1比例腹腔注射麻醉，仰卧于手术台上，将颈部备皮乙醇消毒后，沿颈部正中进行切口，暴露并钝性分离下颌腺体，显微镜下在右侧的肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌和二腹肌形成的三角处分离出右侧的颈总动脉(CCA)，用电凝笔烫断游离出的小分支，分离出颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，仔细分离避免损伤迷走神经，舌、咽神经和气管，用5-0医用真丝编织线将ECA，CCA结扎，另在CCA上打一手术活结，颈内动脉用显微动脉夹夹闭，在颈总动脉上做一切口，将备好的线栓插入颈内动脉到标记处或者直到略感阻力为止，即插入线栓从颈外动脉分叉处9 mm左右，扎紧活结。此时，线栓前端已经阻断大脑中动脉(MCA)起始段及其所有血液供应，造成MCA局灶性缺血，缝合皮肤。手术过程中要保证室温恒定在25 ℃左右，手术结束后放置于恒温清洁笼中卫生饲养。对照组不做任何处理，假手术组按照实验组步骤处理，但是不插入线栓，观察动物情况。弃去手术超过15 min或手术中有出血及麻醉过深的动物。 通过激光多普勒脑血流仪测量小鼠大脑中动脉栓塞后的局部脑血流变化。监测大脑中动脉线栓阻断血流程度，证实模型的成功与否。
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2.3 术后的神经功能评分及TTC染色 整个评分采用单肓法，即评分者不知道实验动物分组情况。采用Longa的5分评分标准[3](0分：无神经损伤症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：行走向对侧旋转；3分：爬行时身体向对侧倾倒；4分：不能自己行走或意识丧失)。1～4分为有效模型。 术后12，24 h后断头取脑，迅速置PBS冰水混合物中，5 min后取出置小鼠脑槽中，行1.0 mm厚的冠状切片，将切片立即置于0.5%TTC磷酸缓冲液中，避光、37 ℃恒温孵育15 min。将染色后脑片置于4%多聚甲醛中固定后，将脑片按脑的前后顺序整齐排列。用数码相机拍摄染色后的脑片，输入计算机内，用图像处理软件计算脑梗死面积。根据公式：体积=100×(对侧半球体积-未梗死的同侧半球体积)/对侧大脑半球体积[5]，算出梗死体积的百分比。
2.4 统计学方法 应用Image J软件对TTC染色结果进行图像分析。处理数据以±s表示，应用SPSS 17.0统计软件，行单因素方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 小鼠脑缺血后神经病学评分 MCAO造模3 h后，小鼠苏醒，恢复反射和自主活动。假手术组未见异常，模型组动物均出现提尾悬空时头向左歪，对侧前肢屈曲内收、肩内旋，肌张力降低，不能完全伸直，自主活动时以对侧后腿为圆心向对侧旋转，甚至倾斜，神经功能学评分结果见表1。, 百拇医药(贾蔷 石作荣 杨洪军)