蒙药查干嘣嘎对生物标志物PGC—1α的活性调节作用(1)
[摘要] 目的：通过体内外实验考察蒙药查干蹦嘎提取物对生物标志物PGC-1α的活性调节作用，为进一步研究裸鼠肿瘤模型的药效学和提取物中的活性成分奠定基础。方法：①70%的乙醇回流提取查干蹦嘎药材粗粉，制备药材提取物冻干粉；②口服给予KM和C57BL/6J小鼠50 mg·kg-1的查干蹦嘎提取物，每天给药1次，连续给药5 d；给予A549细胞不同浓度的查干蹦嘎提取物；③用QT-PCR定量测定动物肺部组织及非小细胞肺癌肿瘤细胞A549中PGC-1α mRNA表达量的变化。结果：在不同品系小鼠的肺组织测定中，PGC-1α的表达量具有增高的趋势。在A549非小细胞肺癌肿瘤细胞的测定中，PGC-1α的表达随着剂量的增加而不断增高，且表现出时间与浓度依耐性关系。结论：蒙药查干蹦嘎能够诱导正常肺部组织与非小细胞肺癌细胞中PGC-1α mRNA表达。目前的实验结果为进一步肿瘤模型的药效学和抗肿瘤活性物质基础的研究奠定基础。
[关键词]蒙药；能量代谢；抗肿瘤；生物标志物；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α
, http://www.100md.com
恶性肿瘤是目前威胁人类健康的主要疾病之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。如何开发出安全有效的抗肿瘤药物新制剂，改善患者的生活质量仍是当前医药学家亟待攻破的难题之一。研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)是近年发现的一种新型辅助转录激活因子，与肿瘤细胞的凋亡及其能量代谢的生理功能密切相关，可能是新的抗肿瘤药物作用生物标志物[1]。 PGC-1α在肿瘤组织中表达水平明显降低，肿瘤的恶性程度越高，降低的程度就越明显。PGC-1α与机体能量代谢存在着密切关系，药物诱导PGC-1α的表达可以促使肿瘤细胞的凋亡[1]。
通过查干嘣嘎对PGC-1α的活性调控研究，筛选与能量代谢相关的抗肿瘤作用有效成分，对于寻找新靶点抗肿瘤制剂具有重要的研究意义。查干嘣嘎是蒙药中的常用药物[2]，也是传统中药中的一种，中药名为附子。附子为毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根，始载于《神农本草经》，为大热、有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效[3]。现代药理研究表明，附子具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖、抗癌、对心血管系统和对神经系统作用等[4]。
, 百拇医药
PGC-1α参与线粒体的多种生物功能并共激活调控核受体和转录因子的活性。在能量需求旺盛，氧化代谢活跃的组织中表达丰富，调控适应性产热和刺激线粒体的生物合成。选取KM及C57BL/6小鼠与能量代谢密切相关的主要组织器官，以PGC-1α为靶标，研究查干嘣嘎总提取物在正常小鼠体内对PGC-1α mRNA表达水平的影响；同时考察查干嘣嘎总提取物对A549非小细胞肺癌细胞株的PGC-1α mRNA表达水平的影响。
1 材料
1.1 动物 KM和C57BL/6健康雄性小鼠，体重20～22 g，SPF 级，由南京大学生命科学院动物实验中心提供。
1.2 细胞 A549非小细胞肺癌肿瘤细胞株由南京大学生命科学院提供。
1.3 药品与试剂 查干嘣嘎(中药附子)的炮制品(生产批号100915-3)购自南京药业股份有限公司；HO-βCD(鲁药准字F2012004)由淄博千汇生物科技有限公司提供；TRIzol RNA提取试剂(货号15596-026)和cDNA合成试剂盒(批号BK1001)，Perfect Real-time-SYBR Premix EX TaqTM试剂盒(批号BKA3102)由宝生物工程(大连)有限公司产品；引物由上海生工生物工程技术公司合成：PGC-1α的上游引物 (5′-3′)CCCGTGGATGAAGACGGATTG，下游引物为(5′-3′)GTGGGTGTGGTTTGCTGCATG；内参GAPDH的上游引物为(5′-3′)TGTGTCCGTCGTGGATCT，下游(5′-3′) CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。
, 百拇医药
1.4 仪器 Roche LightCycler 480实时荧光定量 PCR( 瑞士罗氏公司)，applied biosystems 2720 PCR仪(美国AB公司)，Infinite M200 PRO酶标仪(奥地利TECAN公司)，Thermo Forma 900 SERIES -86 ℃超低温冰箱(美国THERMO Electron公司)，Thermo LEGEND MICRO 17R 1.5 mL低温离心机(美国 THERMO Electron 公司)，Thermo C Multi-Fuge X 1R 50 mL 低温离心机(美国THERMO Electron公司)，Thermo Scientific FORMA DIRECT HEAT CO2 incubator(美国 THERMO Electron 公司)，旋转蒸发仪RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，LGJ-10D冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)。
2 方法
2.1 药材提取 称取查干蹦嘎药材约110 g，加入到1 L的圆底烧瓶中，再加入600 mL的70%乙醇溶液，加热回流提取。提取2次， 每次3 h。合并2次药材提取液，用旋转蒸发仪浓缩成稠浸膏。冷冻干燥得干浸膏，装入50 mL的离心管密封备用。
2.2 提取物溶液的准备 制备灌胃溶液，称取约4.0 g HO-βCD 高分子材料，室温条件下，去离子水将其溶解至浓度为4%，0.22 μm微孔滤膜过滤，2～4 ℃保存备用；精确称取查干嘣嘎总提取物，加4%的HO-βCD溶液超声10 min，于60 ℃水浴加热溶解，补足体积使总浓度为10 g·L-1，2～4 ℃贮存备用。, 百拇医药(李汉青 顼佳音 蔚璐 新吉乐 魏继文)
[关键词]蒙药；能量代谢；抗肿瘤；生物标志物；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α
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恶性肿瘤是目前威胁人类健康的主要疾病之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。如何开发出安全有效的抗肿瘤药物新制剂，改善患者的生活质量仍是当前医药学家亟待攻破的难题之一。研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)是近年发现的一种新型辅助转录激活因子，与肿瘤细胞的凋亡及其能量代谢的生理功能密切相关，可能是新的抗肿瘤药物作用生物标志物[1]。 PGC-1α在肿瘤组织中表达水平明显降低，肿瘤的恶性程度越高，降低的程度就越明显。PGC-1α与机体能量代谢存在着密切关系，药物诱导PGC-1α的表达可以促使肿瘤细胞的凋亡[1]。
通过查干嘣嘎对PGC-1α的活性调控研究，筛选与能量代谢相关的抗肿瘤作用有效成分，对于寻找新靶点抗肿瘤制剂具有重要的研究意义。查干嘣嘎是蒙药中的常用药物[2]，也是传统中药中的一种，中药名为附子。附子为毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根，始载于《神农本草经》，为大热、有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效[3]。现代药理研究表明，附子具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖、抗癌、对心血管系统和对神经系统作用等[4]。
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PGC-1α参与线粒体的多种生物功能并共激活调控核受体和转录因子的活性。在能量需求旺盛，氧化代谢活跃的组织中表达丰富，调控适应性产热和刺激线粒体的生物合成。选取KM及C57BL/6小鼠与能量代谢密切相关的主要组织器官，以PGC-1α为靶标，研究查干嘣嘎总提取物在正常小鼠体内对PGC-1α mRNA表达水平的影响；同时考察查干嘣嘎总提取物对A549非小细胞肺癌细胞株的PGC-1α mRNA表达水平的影响。
1 材料
1.1 动物 KM和C57BL/6健康雄性小鼠，体重20～22 g，SPF 级，由南京大学生命科学院动物实验中心提供。
1.2 细胞 A549非小细胞肺癌肿瘤细胞株由南京大学生命科学院提供。
1.3 药品与试剂 查干嘣嘎(中药附子)的炮制品(生产批号100915-3)购自南京药业股份有限公司；HO-βCD(鲁药准字F2012004)由淄博千汇生物科技有限公司提供；TRIzol RNA提取试剂(货号15596-026)和cDNA合成试剂盒(批号BK1001)，Perfect Real-time-SYBR Premix EX TaqTM试剂盒(批号BKA3102)由宝生物工程(大连)有限公司产品；引物由上海生工生物工程技术公司合成：PGC-1α的上游引物 (5′-3′)CCCGTGGATGAAGACGGATTG，下游引物为(5′-3′)GTGGGTGTGGTTTGCTGCATG；内参GAPDH的上游引物为(5′-3′)TGTGTCCGTCGTGGATCT，下游(5′-3′) CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。
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1.4 仪器 Roche LightCycler 480实时荧光定量 PCR( 瑞士罗氏公司)，applied biosystems 2720 PCR仪(美国AB公司)，Infinite M200 PRO酶标仪(奥地利TECAN公司)，Thermo Forma 900 SERIES -86 ℃超低温冰箱(美国THERMO Electron公司)，Thermo LEGEND MICRO 17R 1.5 mL低温离心机(美国 THERMO Electron 公司)，Thermo C Multi-Fuge X 1R 50 mL 低温离心机(美国THERMO Electron公司)，Thermo Scientific FORMA DIRECT HEAT CO2 incubator(美国 THERMO Electron 公司)，旋转蒸发仪RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，LGJ-10D冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)。
2 方法
2.1 药材提取 称取查干蹦嘎药材约110 g，加入到1 L的圆底烧瓶中，再加入600 mL的70%乙醇溶液，加热回流提取。提取2次， 每次3 h。合并2次药材提取液，用旋转蒸发仪浓缩成稠浸膏。冷冻干燥得干浸膏，装入50 mL的离心管密封备用。
2.2 提取物溶液的准备 制备灌胃溶液，称取约4.0 g HO-βCD 高分子材料，室温条件下，去离子水将其溶解至浓度为4%，0.22 μm微孔滤膜过滤，2～4 ℃保存备用；精确称取查干嘣嘎总提取物，加4%的HO-βCD溶液超声10 min，于60 ℃水浴加热溶解，补足体积使总浓度为10 g·L-1，2～4 ℃贮存备用。, 百拇医药(李汉青 顼佳音 蔚璐 新吉乐 魏继文)