中药新药研究中多糖含量测定方法探讨(1)
[摘要]该文结合新药申报中多糖测定方法中存在的问题，对多糖测定方法的适应范围、对照品的选择、各成分之间的干扰情况、方法研究进展等方面进行了介绍。作者建议：应根据所含多糖的结构及性质选择合适的检测方法，并进行方法学验证，考查所用显色试剂的稳定性、用量、显色时间、最大检测波长等因素，以增加方法的准确性。在多糖的含量测定中应排除单糖及其他水溶性成分的影响；注意对照品的选择；测定波长的选择；关注中性糖和酸性糖测定时的相互干扰，必要时可加入糖抑制剂排除干扰。对于由不同糖残基构成的杂多糖的测定，由于不同单糖的标准曲线的斜率不同，在选择对照品时建议通过研究搞清组成多糖的单糖种类及比例，按此比例配制成混合对照品制作标准曲线，进行测定。
[关键词]中药新药；多糖；含量测定
尽管糖类物质的研究有百年的历史，但长期以来，人们仅把它作为一种能源及细胞结构的支撑物，过于低估了它生命过程中的贡献。随着人类对生命科学深入研究，人们已逐步意识到糖类物质在阐明多细胞生物高层次生命现象中的重要性和必要性，从而揭开了生物化学的一个重大前沿——糖生物学时代，糖类物质的研究已成为学者们关注的焦点。糖的定量、定性测定是糖研究的一个重要基础工作。根据糖的理化性质，如折射率、比重、旋光性、显色反应等设计糖的测定方法，可在一定范围达到所要求的测定目的。下面就现阶段常用的方法中存在的问题进行讨论，以期找到应用于新药研究中测定方法的结合点，更好的控制产品质量。
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1 研究状况
糖类物质是含多羟基的醛类或酮类化合物，以其水解的情况分为单糖、寡糖和多糖。单糖是糖类的组成单元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线形或分枝连接成寡糖和多糖。多糖是由10个以上单糖基通过糖苷键连接而成。2～9个单糖基通过糖苷键连接而成的称作寡糖。由1种单糖组成的多糖称作均多糖，由2种以上单糖组成的多糖称作杂多糖。按其性质又分为中性多糖、酸性多糖、还原糖。
早在20世纪40—50年代，对糖含量测定方法已进行了众多的研究，常用的有比色法、滴定法、高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法等，其中高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法对研究多糖组成应用较多，进行含量测定还需进一步研究完善。现阶段主要还是采用比色法及滴定法较多。但都不是测定多糖的专属性方法。多糖的含量测定是多糖类药物质量控制中考察产品内在质量的项目，也是考察药品稳定性的依据，也是目前研究中的一个难点。经典化学分析法中的蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、碘量法、二硝基水杨酸法、氨基己糖测定法和己糖醛酸测定法等，以及各种色谱法都是通过水解单糖的含量来反映多糖的含量，实际测定的是总糖的含量。由于缺乏对照品， 目前还不能使用HPLC和LPCE直接测定多糖含量。另外，毛细管电泳技术近年来得到迅速发展开始用于多糖的分析。Marsha首次报道用毛细管电泳的激光诱导荧光检测技术，直接测定大相对分子质量多糖，成功地分离了相对分子质量近200万的葡聚糖、褐藻胶等，但还有待进一步研究探讨[1-2]。
, 百拇医药
2 现阶段常用比色法方法中存在问题分析
2.1 方法的适应性 现阶段申报的资料中常用方法为蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、碘量法、二硝基水杨酸法、硫酸卡唑法、间羟基联苯法等，其中硫酸卡唑法、间羟基联苯法常用于测定酸性多糖。有一部分资料仅以葡萄糖为对照，直接用苯酚硫酸法测定多糖含量，实际测得的是总糖的含量，存在着方法专属性、准确性问题。由于目前多糖制品多为未经纯化的粗多糖制剂，其成分复杂，如含有蛋白质、生物碱、多糖的不同组分及其他水溶性成分，因此在测定时，应进行前处理，排除干扰。有文献报道[3]前处理时采用乙醇先进行醇沉提取多糖，排除小分子物质、单糖、寡糖的干扰，再进行除蛋白步骤，以纯化和排除蛋白的干扰，再进行测定。尤其对于复方制剂中多糖的含量测定更应增加前处理步骤，同时增加多糖对照品的薄层鉴别方法，规定在检查时不得检出单糖。
2.2 对照品的选择 苯酚-硫酸法测总糖含量是目前被广泛使用的一种经典方法，它适用于对单糖、寡糖以及均多糖的含量测定。但对于均多糖，可直接以其组成糖作标准曲线。对于由不同糖残基构成的杂多糖，情况则较为复杂， 实验发现， 因为不同单糖的标准曲线的斜率不同，对于杂多糖采用此法在不同的条件下，其测得的结果均有差异。因此对照品的选择在比色法测定多糖含量中就显得比较重要。
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林颍等[4]采用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法分别测定了组成多糖的单糖的标准曲线及按单糖组成比例配置的标准溶液的标准曲线，分别进行计算，进行含量比较，结果认为，相同浓度的葡萄糖、果糖、半乳糖溶液所作出的标准曲线是不重合的，即同一样品用不同的标准溶液测定的含量值均不同。硫酸蒽酮法中标准曲线间的偏差小于苯酚硫酸法。由于是以某种单糖为标准，对杂多糖而言，测定值与真实值有差别，但对未知确切多糖比例的样品，可用主要组成单糖为标准，再用2种方法分别作样品组成单糖的标准曲线，根据其斜率偏差，选取小者作为测定方法，可得近似结果。对于均多糖2种方法测得的结果相近。对于杂多糖建议按其实际的单糖组成比例配制成标准溶液进行测定。
杨勇杰等[5]采用苯酚硫酸法测定了银耳杂多糖的含量。先采用气相色谱法对组成多糖的单糖的组成进行分析，主要为岩藻糖、木糖、甘露糖及葡萄糖。在测定时如果选用显色最强的葡萄糖作标准曲线，则测定结果偏低；如果选用显色最弱的岩藻糖作标准曲线，测定结果远超出实际值。采取GC结合校正因子也可以计算出总糖含量，但是这种方法烦琐，实验过程复杂。若样品较多则每测量一次都要把所有样品都经过衍生、气相测定，内标换算含量等步骤，不适合实际操作。本文实验尝试按照各单糖的组成百分比制作混合标准曲线， 为改良的苯酚硫酸法，该法只需要在方法确立的时候使用GC确定混合标准曲线中各标准单糖的比例，在以后的实验中就无须用GC了，这大大缩短了实验时间，而且也使结果比原来的苯酚硫酸法相对准确得多。同时还考察了样品水解前后测定结果的影响，结果表明，水解后样品测定结果高于未水解样品10多个百分点，原因可能是由于多糖中的糖残基以结合形式存在，和单糖有所不同，在浓硫酸的作用下不能百分之百形成糠醛，影响了测定结果。有人提出用多糖校正因子来修正，但这更适合于均多糖，比如葡萄糖聚糖，而对于杂多糖并不适用。, 百拇医药(李计萍)
[关键词]中药新药；多糖；含量测定
尽管糖类物质的研究有百年的历史，但长期以来，人们仅把它作为一种能源及细胞结构的支撑物，过于低估了它生命过程中的贡献。随着人类对生命科学深入研究，人们已逐步意识到糖类物质在阐明多细胞生物高层次生命现象中的重要性和必要性，从而揭开了生物化学的一个重大前沿——糖生物学时代，糖类物质的研究已成为学者们关注的焦点。糖的定量、定性测定是糖研究的一个重要基础工作。根据糖的理化性质，如折射率、比重、旋光性、显色反应等设计糖的测定方法，可在一定范围达到所要求的测定目的。下面就现阶段常用的方法中存在的问题进行讨论，以期找到应用于新药研究中测定方法的结合点，更好的控制产品质量。
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1 研究状况
糖类物质是含多羟基的醛类或酮类化合物，以其水解的情况分为单糖、寡糖和多糖。单糖是糖类的组成单元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线形或分枝连接成寡糖和多糖。多糖是由10个以上单糖基通过糖苷键连接而成。2～9个单糖基通过糖苷键连接而成的称作寡糖。由1种单糖组成的多糖称作均多糖，由2种以上单糖组成的多糖称作杂多糖。按其性质又分为中性多糖、酸性多糖、还原糖。
早在20世纪40—50年代，对糖含量测定方法已进行了众多的研究，常用的有比色法、滴定法、高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法等，其中高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法对研究多糖组成应用较多，进行含量测定还需进一步研究完善。现阶段主要还是采用比色法及滴定法较多。但都不是测定多糖的专属性方法。多糖的含量测定是多糖类药物质量控制中考察产品内在质量的项目，也是考察药品稳定性的依据，也是目前研究中的一个难点。经典化学分析法中的蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、碘量法、二硝基水杨酸法、氨基己糖测定法和己糖醛酸测定法等，以及各种色谱法都是通过水解单糖的含量来反映多糖的含量，实际测定的是总糖的含量。由于缺乏对照品， 目前还不能使用HPLC和LPCE直接测定多糖含量。另外，毛细管电泳技术近年来得到迅速发展开始用于多糖的分析。Marsha首次报道用毛细管电泳的激光诱导荧光检测技术，直接测定大相对分子质量多糖，成功地分离了相对分子质量近200万的葡聚糖、褐藻胶等，但还有待进一步研究探讨[1-2]。
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2 现阶段常用比色法方法中存在问题分析
2.1 方法的适应性 现阶段申报的资料中常用方法为蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、碘量法、二硝基水杨酸法、硫酸卡唑法、间羟基联苯法等，其中硫酸卡唑法、间羟基联苯法常用于测定酸性多糖。有一部分资料仅以葡萄糖为对照，直接用苯酚硫酸法测定多糖含量，实际测得的是总糖的含量，存在着方法专属性、准确性问题。由于目前多糖制品多为未经纯化的粗多糖制剂，其成分复杂，如含有蛋白质、生物碱、多糖的不同组分及其他水溶性成分，因此在测定时，应进行前处理，排除干扰。有文献报道[3]前处理时采用乙醇先进行醇沉提取多糖，排除小分子物质、单糖、寡糖的干扰，再进行除蛋白步骤，以纯化和排除蛋白的干扰，再进行测定。尤其对于复方制剂中多糖的含量测定更应增加前处理步骤，同时增加多糖对照品的薄层鉴别方法，规定在检查时不得检出单糖。
2.2 对照品的选择 苯酚-硫酸法测总糖含量是目前被广泛使用的一种经典方法，它适用于对单糖、寡糖以及均多糖的含量测定。但对于均多糖，可直接以其组成糖作标准曲线。对于由不同糖残基构成的杂多糖，情况则较为复杂， 实验发现， 因为不同单糖的标准曲线的斜率不同，对于杂多糖采用此法在不同的条件下，其测得的结果均有差异。因此对照品的选择在比色法测定多糖含量中就显得比较重要。
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林颍等[4]采用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法分别测定了组成多糖的单糖的标准曲线及按单糖组成比例配置的标准溶液的标准曲线，分别进行计算，进行含量比较，结果认为，相同浓度的葡萄糖、果糖、半乳糖溶液所作出的标准曲线是不重合的，即同一样品用不同的标准溶液测定的含量值均不同。硫酸蒽酮法中标准曲线间的偏差小于苯酚硫酸法。由于是以某种单糖为标准，对杂多糖而言，测定值与真实值有差别，但对未知确切多糖比例的样品，可用主要组成单糖为标准，再用2种方法分别作样品组成单糖的标准曲线，根据其斜率偏差，选取小者作为测定方法，可得近似结果。对于均多糖2种方法测得的结果相近。对于杂多糖建议按其实际的单糖组成比例配制成标准溶液进行测定。
杨勇杰等[5]采用苯酚硫酸法测定了银耳杂多糖的含量。先采用气相色谱法对组成多糖的单糖的组成进行分析，主要为岩藻糖、木糖、甘露糖及葡萄糖。在测定时如果选用显色最强的葡萄糖作标准曲线，则测定结果偏低；如果选用显色最弱的岩藻糖作标准曲线，测定结果远超出实际值。采取GC结合校正因子也可以计算出总糖含量，但是这种方法烦琐，实验过程复杂。若样品较多则每测量一次都要把所有样品都经过衍生、气相测定，内标换算含量等步骤，不适合实际操作。本文实验尝试按照各单糖的组成百分比制作混合标准曲线， 为改良的苯酚硫酸法，该法只需要在方法确立的时候使用GC确定混合标准曲线中各标准单糖的比例，在以后的实验中就无须用GC了，这大大缩短了实验时间，而且也使结果比原来的苯酚硫酸法相对准确得多。同时还考察了样品水解前后测定结果的影响，结果表明，水解后样品测定结果高于未水解样品10多个百分点，原因可能是由于多糖中的糖残基以结合形式存在，和单糖有所不同，在浓硫酸的作用下不能百分之百形成糠醛，影响了测定结果。有人提出用多糖校正因子来修正，但这更适合于均多糖，比如葡萄糖聚糖，而对于杂多糖并不适用。, 百拇医药(李计萍)