基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究(2)
2.2 ITS序列分析 将3种药材荒漠肉苁蓉,黄花列当以及锁阳的51个个体的ITS序列进行比对分析,所得DNA序列用CONTIG软件同源对齐,并辅以人工校对。排序后的序列使用BioEdit分析软件进行分析处理。用MEGA 4.0 软件对各样品ITS序列的差异性进行分析,并采用邻接法(NJ法)构建系统发育树,并以Bootstrap作1 000次可信度分析,且cutoff取不小于50%。2.3 鉴别引物的设计 用BioEdit分析软件对ITS序列进行分析、多重比对,找出具有稳定差异的变异位点,筛选获得变异位点,通过该位点利用 Primer Premier 5.0软件设计一对用于荒漠肉苁蓉鉴别的特异引物CD_1F/CD_1R,设计的特异引物扩增后片段大小为331 bp,引物序列见表2。
2.4 位点特异性PCR鉴别反应的建立 取荒漠肉苁蓉,锁阳和黄花列当不同样品的DNA进行位点特异性PCR,PCR反应体系为2.5 μL 10 × Ex Taq buffer缓冲液,2 μL (10 mmol·L-1) dNTPs ......
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